Redoslijed zadnjeg čitanja revolucionarizira dijagnostiku rijetkih bolesti

Redoslijed zadnjeg čitanja revolucionarizira dijagnostiku rijetkih bolesti

Jedan od 10 ljudi u svijetu ima rijedak genetski poremećaj, ali oko 50% njih ostaje nedijagnosticirano unatoč brzom porastu genetske tehnologije i testiranja. Čak i ako osoba ima pristup testiranju, proces postavljanja dijagnoze može potrajati oko pet godina ili duže, što je ponekad prekasno da pacijenti, koji su često djeca, počnu pravilno liječiti.

To je djelomično zato što trenutno kliničko testiranje koristi metodu zvanu sekvenciranje kratkog čitanja, koja ne može pristupiti informacijama u određenim regijama genoma i stoga ne može dati ključne dokaze za dijagnozu. Međutim, istraživači s UC Santa Cruz napreduju prema vrhunskoj alternativnoj metodi, nazvanoj Lonad sekvenciranje, koja može pružiti sveobuhvatniji skup podataka za identificiranje varijacija, eliminirati potrebu za višestrukim specijaliziranim testovima i optimizirati dijagnozu rijetkih bolesti.

Nova studija pokazuje da dugotrajno sekvenciranje ima potencijal poboljšati stopu dijagnoze dok smanjuje vrijeme postavljanja dijagnoze s godina na dane - u jednom testu i po puno nižoj cijeni. Studija je objavljena uAmerički časopis za ljudsku genetikui predvođeni glavnim članovima Genomskog instituta UCSC-a, profesorom biomolekularnog inženjerstva (BME) Benedikt Paten i izvanrednom profesoricom BME-a Karen Miga, kao i bivšom postdoktorandicom UCSC-a Jean Monlong.

Rijetke bolesti nešto su s čime se ljudi bore toliko godina, a ako imamo tehnologiju sekvenciranja koja optimizira dijagnostičko testiranje, to će biti veliki doprinos - a to je ono što smo testirali u sklopu ovog rada. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, prvi autor rada

"Danas je dijagnostički učinak genetskog sekvenciranja frustrirajuće nizak", rekao je Paten. “Vjerojatan uzrok su nepotpune metode sekvenciranja, varijante i epigenetski signali u našoj kohorti.

Pronađite rijetke bolesti

Ova se studija usredotočila na rijetke monogene bolesti uzrokovane poremećajem jednog gena.

Znanstvenici dijagnosticiraju genetske bolesti pretražujući njihov genetski materijal kako bi pronašli varijante - razlike u genu koje ga mogu spriječiti u pravilnom funkcioniranju. Tipičan pristup pronalaženju ovih varijanti koristi se tehnikom koja se naziva sekvenciranje kratkog čitanja, koja mapira genetske parove baza—kombinacije adenina (A), citozina (C), gvanina (G) i timina (T)—u sekvencama od oko 150-250 svaki.

Međutim, ograničenje kratkog čitanja sekvenciranja je to što može propustiti ključne informacije u određenim regijama genoma, kao što su uzorci parova baza koji su puno duži od samo 250 parova baza. Niti može izvesti "faziranje", proces određivanja koje su varijante naslijeđene od majke, a koje dolaze od oca. To može pomoći kliničarima da otkriju koje su varijante naslijeđene. Na primjer, kada su dvije varijante naslijeđene od istog roditelja, po jedna od svakog roditelja ili se uopće ne nasljeđuju. Ovo može biti vrlo korisna informacija za genetsku dijagnozu, osobito kada podaci o roditeljima nisu dostupni.

Nasuprot tome, dugotrajno sekvenciranje može čitati duge dijelove DNK istovremeno, eliminirajući praznine koje mogu uzrokovati da znanstvenici i kliničari propuste važne informacije o varijacijama gena. Sekvenciranje dugotrajnog očitavanja također pruža izravne fazne podatke kao i informacije o metilaciji, kemijskom procesu u DNK koji uzrokuje "uključivanje ili isključivanje" gena i može doprinijeti bolesti.

"Dugotrajno sekvenciranje bit će puno bolje u određenim slučajevima, a mi poduzimamo korake da to dokažemo", rekao je Negi.

Voditi u metodama

Istraživači Instituta za genomiku UC Santa Cruz imaju dugu povijest inovacija i stručnosti u dugovječnom sekvenciranju i aktivno razvijaju metode za optimiziranje sekvenciranja i analize za širok raspon aplikacija u zdravstvenim istraživanjima. Mnoge od tehnika koje su istraživači razvili kako bi postigli postignuća, kao što je prvi doista potpuni referentni genom "telomera-telomera", sada se koriste za poboljšanje ishoda pacijenata.

"Ako se prethodna otkrića pojačaju, otkrili smo da su prednosti korištenja dugovječnog sekvencioniranja značajno povećane upotrebom cjelovitog, takozvanog 'telomera-telomera' referentnog genoma umjesto postojeće nepotpune, ali naširoko korištene genomske reference", rekla je MIGA. "Predviđamo da će pangenomi - reference koje predstavljaju različite ljudske varijacije - imati još više koristi od novih dugovječnih tehnologija sekvenciranja."

Laboratoriji Patena i Mige udružili su se s kliničarima kako bi radili na slučajevima 42 pacijenta s rijetkim bolestima - od kojih su neki dijagnosticirani metodama kratkog čitanja ili drugim specijaliziranim testovima, od kojih neki još nisu bili dijagnosticirani. U nekim su slučajevima istraživači imali pristup genetskim informacijama roditelja, ali u drugima nisu.

Laboratorij MIGA proveo je dugovječno sekvencioniranje pacijenata koristeći Nanopore sekvencioniranje, dugovječnu metodu sekvencioniranja na UCSC-u, kako bi se postiglo vrlo precizno očitavanje genoma pacijenata od početka do kraja za približno 1000 dolara po uzorku.

Genomski podaci analizirani su pomoću računalnih metoda razvijenih u laboratoriju Paten kako bi se pronašle male i velike varijante, podaci o fazi i podaci o metilaciji, a sve pomoću cjevovoda koji se zove NAPU cjevovod. Proces analize traje oko jedan dan ili manje, ovisno o brzini računalne obrade, a košta 100 USD.

rješavati slučajeve

Nakon sekvenciranja i analize podataka o pacijentima, istraživači su otkrili da očitanja dugog čitanja pružaju sveobuhvatniji skup podataka u usporedbi s onim što se može izvesti pomoću sekvenciranja kratkog čitanja.

Sekvenciranje dugotrajnog očitavanja dalo je konačnu dijagnozu za 11 od 42 pacijenta u kohorti, pružajući sve od podataka kratkog očitavanja kao i dodatne informacije uključujući dodatne rijetke varijante kandidata, faziranje dugog dometa i metilaciju - sve u jednom, jeftinom i brzom protokolu.

U 11 dijagnosticiranih slučajeva uključene su četiri kongenitalne adrenalne hipoplazije (rijetko stanje u kojem su nadbubrežne žlijezde povećane i ne funkcioniraju ispravno). Gen odgovoran za ovu bolest nalazi se u posebno izazovnom području genoma - ne može se karakterizirati pomoću tehnologije sekvenciranja kratkog čitanja, a trenutno kliničko testiranje je glomazno i ​​nepotpuno.

"Kako bismo riješili ove slučajeve, razvili smo novi pan-genomski alat koji integrira nove visokokvalitetne sklopove kao što je referentni genom "telomeri-telomeri" trenutni položaj na INSERM-u u Francuskoj. "Bili smo uzbuđeni vidjeti ljudski genom, koji je kroz povijest bilo teško proučavati. Naši rezultati potiču nas da proširimo svoj pristup na više bolesti koje su odavno u zastoju."

Osim toga, u dva slučaja radilo se o poremećajima spolnog razvoja, dok je rijedak slučaj hipoplazije Leydigovih stanica zbog nerazvijenih Leydigovih stanica u testisima utjecao na spolni razvoj muškarca. Osim toga, konačno su riješena četiri slučaja neurorazvojnih poremećaja, od kojih je svaki predstavljao dugu i izazovnu dijagnostičku odiseju.

"Dugo očitano sekvenciranje vjerojatno je sljedeći najbolji test za neriješene slučajeve s uvjerljivim varijantama u jednom genu ili jasnom fenotipu", rekao je Negi. "Može poslužiti kao jedan dijagnostički test, smanjujući potrebu za više kliničkih posjeta i pretvarajući višegodišnje dijagnostičko putovanje u nekoliko sati."

U prosjeku je svaki pacijent imao 280 gena (uključujući neke gene Mendelove bolesti povezane s nasljednim bolestima uzrokovanim mutacijama jednog gena) sa značajnim regijama kodiranja proteina koje su jasno pokrivene dugim čitanjima i neotkrivene kratkim čitanjima.

"Postoji mnogo više genoma koje dugo čitanje može otključati", rekao je Negi. "Ali trebat će vremena prije nego što možemo u potpunosti protumačiti ove nove informacije otkrivene dugim čitanjima. Ti podaci nisu bili prisutni u našim kliničkim bazama podataka. Čitanja otkrivaju oko 5,8% više genoma telomera-telomera kojima kratka čitanja jednostavno nisu mogla pristupiti."

Drugi istraživači s UC Santa Cruza uključeni u ovo istraživanje su Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker i Sara O’Rourke.

Ovo istraživanje djelomično je financirala Chan Zuckerberg Initiative.

Izvori: