Il sequenziamento dell’ultima lettura sta rivoluzionando la diagnosi delle malattie rare

Il sequenziamento dell’ultima lettura sta rivoluzionando la diagnosi delle malattie rare

Una persona su 10 nel mondo è affetta da una malattia genetica rara, ma circa il 50% di loro non viene diagnosticata nonostante il rapido incremento della tecnologia genetica e dei test. Anche se una persona ha accesso ai test, il processo di diagnosi può richiedere circa cinque anni o più, il che a volte è troppo tardi perché i pazienti, che spesso sono bambini, possano iniziare un trattamento adeguato.

Ciò è in parte dovuto al fatto che gli attuali test clinici utilizzano un metodo chiamato sequenziamento a lettura breve, che non può accedere alle informazioni in alcune regioni del genoma e quindi non può fornire prove cruciali per la diagnosi. Tuttavia, i ricercatori dell’UC Santa Cruz stanno procedendo verso un metodo alternativo all’avanguardia, chiamato sequenziamento di Lonad, che può fornire un set di dati più completo per identificare le variazioni, eliminare la necessità di più test specializzati e ottimizzare la diagnosi delle malattie rare.

Un nuovo studio mostra che il sequenziamento a lungo termine ha il potenziale per migliorare i tassi di diagnosi riducendo i tempi di diagnosi da anni a giorni, in un singolo test e a un costo molto inferiore. Lo studio è stato pubblicato inIl giornale americano di genetica umanae guidato dai membri principali del professore di ingegneria biomolecolare (BME) dell'UCSC Genomic Institute Benedikt Paten e dal professore associato di BME Karen Miga, nonché dall'ex studioso post-dottorato dell'UCSC Jean Monlong.

Le malattie rare sono qualcosa con cui le persone lottano da così tanti anni, e se disponiamo di una tecnologia di sequenziamento in grado di ottimizzare i test diagnostici, ciò rappresenterà un enorme contributo – ed è ciò che abbiamo testato in questo articolo. “

Shloka Negi, Ph.D. dell'UC Santa Cruz Bme. studente, primo autore dell'articolo

"Oggi, il rendimento diagnostico del sequenziamento genetico è frustrantemente basso", ha affermato Paten. “Una causa probabile sono i metodi di sequenziamento, le varianti e i segnali epigenetici incompleti nella nostra coorte.

Trova malattie rare

Questo studio si è concentrato sulle malattie monogeniche rare causate da un disturbo di un singolo gene.

Gli scienziati diagnosticano le malattie genetiche ricercando nel materiale genetico le varianti, ovvero le differenze in un gene che possono impedirne il corretto funzionamento. L'approccio tipico per trovare queste varianti utilizza una tecnica chiamata sequenziamento a lettura breve, che mappa le coppie di basi genetiche - combinazioni di adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T) - in sequenze di circa 150-250 ciascuna.

Tuttavia, il limite del sequenziamento a lettura breve è che può perdere informazioni cruciali in alcune regioni del genoma, come modelli di paia di basi che sono molto più lunghi di sole 250 paia di basi. Né può eseguire la “fasatura”, il processo per determinare quali varianti sono ereditate dalla madre e quali provengono dal padre. Ciò può aiutare i medici a scoprire quali varianti sono ereditate. Ad esempio, quando due varianti vengono ereditate dallo stesso genitore, una da ciascun genitore o non vengono ereditate affatto. Questa può essere un'informazione molto utile per le diagnosi genetiche, soprattutto quando i dati dei genitori non sono disponibili.

Al contrario, il sequenziamento a lunga durata può leggere simultaneamente lunghi tratti di DNA, eliminando le lacune che possono far sì che scienziati e medici perdano informazioni importanti sulla variazione genetica. Il sequenziamento a lettura lunga fornisce anche dati di fase diretti e informazioni sulla metilazione, un processo chimico nel DNA che provoca l’“accensione o lo spegnimento” dei geni e può contribuire alla malattia.

"Il sequenziamento a lungo termine sarà molto migliore in alcuni casi e stiamo adottando misure per dimostrarlo", ha detto Negi.

Guida nei metodi

I ricercatori dell'UC Santa Cruz Genomics Institute vantano una lunga storia di innovazione ed esperienza nel sequenziamento di lunga durata e stanno sviluppando attivamente metodi per ottimizzare il sequenziamento e l'analisi per un'ampia gamma di applicazioni di ricerca sanitaria. Molte delle tecniche che i ricercatori hanno sviluppato per raggiungere risultati, come il primo genoma di riferimento “telomero-telomero” veramente completo, vengono ora utilizzate per migliorare i risultati dei pazienti.

"Se i risultati precedenti fossero rafforzati, abbiamo scoperto che i vantaggi dell'utilizzo del sequenziamento a lunga durata sarebbero significativamente aumentati utilizzando un genoma di riferimento completo, il cosiddetto 'telomero-telomero', invece del riferimento genomico esistente incompleto ma ampiamente utilizzato", ha affermato MIGA. "Prevediamo che i pangenomi - riferimenti che rappresentano diverse variazioni umane - trarranno ancora maggiori benefici dalle nuove tecnologie di sequenziamento di lunga durata".

I laboratori di Paten e Miga hanno collaborato con i medici per lavorare su casi di 42 pazienti affetti da malattie rare, alcuni dei quali sono stati diagnosticati tramite metodi di lettura breve o altri test specializzati, altri non ancora diagnosticati. In alcuni casi, i ricercatori avevano accesso alle informazioni genetiche dei genitori, ma in altri no.

Il sequenziamento a lunga durata dei pazienti è stato condotto dal laboratorio MIGA utilizzando il sequenziamento Nanopore, un metodo di sequenziamento a lunga durata presso l'UCSC, per ottenere letture end-to-end altamente accurate dei genomi dei pazienti per circa $ 1.000 per campione.

I dati genomici sono stati analizzati utilizzando metodi computazionali sviluppati nel laboratorio Paten per trovare varianti piccole e grandi, dati di fase e dati di metilazione, il tutto utilizzando una pipeline chiamata NAPU pipeline. Il processo di analisi dura circa un giorno o meno, a seconda della velocità di elaborazione del computer, e costa $ 100.

risolvere casi

Dopo aver sequenziato e analizzato i dati dei pazienti, i ricercatori hanno scoperto che le letture a lettura lunga fornivano un set di dati più completo rispetto a quello che può essere derivato utilizzando il sequenziamento a lettura breve.

Il sequenziamento a lettura lunga ha fornito una diagnosi conclusiva per 11 dei 42 pazienti nella coorte, fornendo di tutto, dai dati a lettura breve, a informazioni aggiuntive tra cui ulteriori varianti candidate rare, fasatura a lungo raggio e metilazione, il tutto in un unico protocollo economico e rapido.

Gli 11 casi diagnosticati includevano quattro ipoplasie surrenali congenite (una rara condizione in cui le ghiandole surrenali sono ingrossate e non funzionano correttamente). Il gene responsabile di questa malattia si trova in una regione particolarmente complessa del genoma: non può essere caratterizzato utilizzando la tecnologia di sequenziamento a lettura breve e gli attuali test clinici sono macchinosi e incompleti.

"Per risolvere questi casi, abbiamo sviluppato un nuovo strumento pan-genomico che integra nuovi assemblaggi di alta qualità come il genoma di riferimento "telomeri-telomeri", posizione attuale presso l'INSERM in Francia. "Eravamo entusiasti di vedere il genoma umano, che storicamente è stato difficile da studiare. I nostri risultati ci incoraggiano ad espandere il nostro approccio a più malattie che sono state a lungo in fase di stallo”.

Inoltre, due casi riguardavano disturbi dello sviluppo sessuale, mentre un raro caso di ipoplasia delle cellule di Leydig dovuta a cellule di Leydig sottosviluppate nei testicoli ha influenzato lo sviluppo sessuale maschile. Inoltre, sono stati finalmente risolti quattro casi di disturbi dello sviluppo neurologico, ciascuno dei quali rappresenta una lunga e impegnativa odissea diagnostica.

"Il sequenziamento a lettura lunga è probabilmente il prossimo miglior test per i casi irrisolti con varianti convincenti in un singolo gene o un fenotipo chiaro", ha detto Negi. "Può fungere da singolo test diagnostico, riducendo la necessità di più visite cliniche e convertendo un percorso diagnostico durato anni in poche ore."

In media, ogni paziente aveva 280 geni (compresi alcuni geni della malattia mendeliana associati a malattie ereditarie causate da mutazioni di un singolo gene) con regioni codificanti proteine ​​​​significative che sono chiaramente coperte da letture lunghe e non rilevate da letture brevi.

"C'è molto di più del genoma che le lunghe letture possono sbloccare", ha detto Negi. "Ma ci vorrà del tempo prima di poter interpretare pienamente queste nuove informazioni rivelate dalle letture lunghe. Questi dati non erano presenti nei nostri database clinici. Le letture scoprono circa il 5,8% in più del genoma telomero-telomero a cui le letture brevi semplicemente non potevano accedere."

Altri ricercatori della UC Santa Cruz coinvolti in questa ricerca includono Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker e Sara O'Rourke.

Questa ricerca è stata in parte finanziata dalla Chan Zuckerberg Initiative.

Fonti: