Last Read-sequencing zorgt voor een revolutie in de diagnose van zeldzame ziekten

Last Read-sequencing zorgt voor een revolutie in de diagnose van zeldzame ziekten

Eén op de tien mensen wereldwijd wordt getroffen door een zeldzame genetische aandoening, maar ongeveer 50% van hen blijft ongediagnosticeerd ondanks de snelle toename van genetische technologie en testen. Zelfs als iemand toegang heeft tot tests, kan het diagnoseproces ongeveer vijf jaar of langer duren, wat soms te laat is voor patiënten, vaak kinderen, om met de juiste behandeling te beginnen.

Dit komt deels doordat de huidige klinische tests gebruik maken van een methode die short-read sequencing wordt genoemd en die geen toegang heeft tot informatie in bepaalde delen van het genoom en daarom geen cruciaal bewijs kan leveren voor de diagnose. Onderzoekers van UC Santa Cruz gaan echter vooruit naar een baanbrekende alternatieve methode, genaamd Lonad-sequencing, die een uitgebreidere dataset kan bieden voor het identificeren van variaties, de noodzaak van meerdere gespecialiseerde tests kan elimineren en de diagnose van zeldzame ziekten kan optimaliseren.

Een nieuwe studie toont aan dat sequencing met een lange levensduur het potentieel heeft om de diagnosecijfers te verbeteren en tegelijkertijd de tijd tot diagnose te verkorten van jaren naar dagen – in één enkele test en tegen veel lagere kosten. Het onderzoek is gepubliceerd inHet Amerikaanse tijdschrift voor menselijke geneticaen geleid door kernleden van het UCSC Genomic Institute, hoogleraar Biomolecular Engineering (BME) Benedikt Paten en universitair hoofddocent van BME Karen Miga, evenals voormalig UCSC postdoctoraal onderzoeker Jean Monlong.

Zeldzame ziekten zijn iets waar mensen al zoveel jaren mee worstelen, en als we sequencing-technologie hebben die diagnostische tests optimaliseert, zal dat een enorme bijdrage leveren - en dat is wat we hebben getest als onderdeel van dit artikel. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, eerste auteur van het artikel

“Tegenwoordig is de diagnostische opbrengst van genetische sequencing frustrerend laag”, zegt Paten. “Een waarschijnlijke oorzaak zijn de onvolledige sequentiemethoden, varianten en epigenetische signalen in ons cohort.

Vind zeldzame ziekten

Deze studie richtte zich op zeldzame monogene ziekten veroorzaakt door een aandoening van één enkel gen.

Wetenschappers diagnosticeren genetische ziekten door in hun genetisch materiaal te zoeken naar varianten: verschillen in een gen die kunnen voorkomen dat het goed functioneert. De typische aanpak om deze varianten te vinden maakt gebruik van een techniek die short-read sequencing wordt genoemd en die genetische basenparen – combinaties van adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en thymine (T) – in kaart brengt in sequenties van elk ongeveer 150-250.

De beperking van short-read sequencing is echter dat cruciale informatie in bepaalde delen van het genoom kan worden gemist, zoals patronen van basenparen die veel langer zijn dan slechts 250 basenparen. Ook kan het geen ‘fasering’ uitvoeren, het proces waarbij wordt bepaald welke varianten van de moeder worden geërfd en welke van de vader komen. Dit kan artsen helpen ontdekken welke varianten erfelijk zijn. Wanneer bijvoorbeeld twee varianten worden geërfd van dezelfde ouder, één van elke ouder, of helemaal niet worden geërfd. Dit kan zeer nuttige informatie zijn voor genetische diagnoses, vooral als er geen ouderlijke gegevens beschikbaar zijn.

Daarentegen kan langlevende sequencing tegelijkertijd lange stukken DNA lezen, waardoor hiaten worden geëlimineerd die ertoe kunnen leiden dat wetenschappers en artsen belangrijke informatie over genvariatie missen. Long-read sequencing levert ook directe fasegegevens op, evenals informatie over methylering, een chemisch proces in DNA dat ervoor zorgt dat genen ‘aan of uit worden gezet’ en kan bijdragen aan ziekten.

“Langdurige sequencing zal in bepaalde gevallen veel beter zijn, en we ondernemen stappen om dat te bewijzen,” zei Negi.

Leid in methoden

Onderzoekers van het UC Santa Cruz Genomics Institute hebben een uitgebreide geschiedenis van innovatie en expertise op het gebied van langlevende sequencing en ontwikkelen actief methoden om sequencing en analyse te optimaliseren voor een breed scala aan gezondheidsonderzoekstoepassingen. Veel van de technieken die onderzoekers hebben ontwikkeld om resultaten te bereiken, zoals het eerste echt complete ‘telomeer-telomeer’-referentiegenoom, worden nu gebruikt om de resultaten voor patiënten te verbeteren.

"Als eerdere bevindingen werden versterkt, ontdekten we dat de voordelen van het gebruik van langlevende sequencing aanzienlijk werden vergroot door het gebruik van een compleet, zogenaamd 'telomeer-telomeer' referentiegenoom in plaats van de bestaande onvolledige maar veelgebruikte genomische referentie, " zei MIGA. "We verwachten dat pangenomen - referenties die diverse menselijke variaties vertegenwoordigen - nog meer zullen profiteren van nieuwe, langlevende sequencing-technologieën."

De laboratoria van Paten en Miga werkten samen met artsen om te werken aan gevallen van 42 patiënten met zeldzame ziekten - van wie sommigen werden gediagnosticeerd via korte leesmethoden of andere gespecialiseerde tests, van wie sommigen nog niet waren gediagnosticeerd. In sommige gevallen hadden onderzoekers toegang tot de genetische informatie van ouders, maar in andere gevallen niet.

Langlevende sequencing van de patiënten werd uitgevoerd door het MIGA-laboratorium met behulp van Nanopore-sequencing, een langlevende sequencing-methode bij UCSC, om zeer nauwkeurige, end-to-end metingen van de genomen van de patiënten te verkrijgen voor ongeveer $ 1.000 per monster.

De genomische gegevens werden geanalyseerd met behulp van computermethoden die in het Paten-laboratorium waren ontwikkeld om kleine en grote varianten, fasegegevens en methylatiegegevens te vinden, allemaal met behulp van een pijplijn genaamd de NAPU-pijplijn. Het analyseproces duurt ongeveer een dag of minder, afhankelijk van de snelheid van de computerverwerking, en kost $ 100.

zaken oplossen

Na het sequencen en analyseren van patiëntgegevens ontdekten onderzoekers dat lang gelezen metingen een uitgebreidere dataset opleverden vergeleken met wat kan worden afgeleid met behulp van kort gelezen sequencing.

Long-read sequencing leverde een sluitende diagnose op voor 11 van de 42 patiënten in het cohort, waarbij alles uit de short-read data werd geleverd, evenals aanvullende informatie, waaronder aanvullende zeldzame kandidaatvarianten, fasering op lange afstand en methylering - alles in één enkel, goedkoop en snel protocol.

Bij de elf gediagnosticeerde gevallen waren vier congenitale bijnierhypoplasieën (een zeldzame aandoening waarbij de bijnieren vergroot zijn en niet goed functioneren). Het gen dat verantwoordelijk is voor deze ziekte bevindt zich in een bijzonder uitdagende regio van het genoom. Het kan niet worden gekarakteriseerd met behulp van short-read sequencing-technologie, en de huidige klinische tests zijn omslachtig en onvolledig.

"Om deze gevallen op te lossen, hebben we een nieuw pan-genomisch hulpmiddel ontwikkeld dat nieuwe hoogwaardige assemblages integreert, zoals het referentiegenoom 'telomeres-telomeres', de huidige positie bij INSERM in Frankrijk. "We waren enthousiast om het menselijk genoom te zien, dat historisch gezien moeilijk te bestuderen is geweest. Onze resultaten moedigen ons aan om onze aanpak uit te breiden naar meer ziekten die al lang tot stilstand zijn gekomen."

Bovendien hadden twee gevallen betrekking op stoornissen in de seksuele ontwikkeling, terwijl een zeldzaam geval van Leydig-celhypoplasie als gevolg van onderontwikkelde Leydig-cellen in de teelballen de mannelijke seksuele ontwikkeling beïnvloedde. Bovendien zijn vier gevallen van neurologische ontwikkelingsstoornissen, die elk een lange en uitdagende diagnostische odyssee vertegenwoordigen, eindelijk opgelost.

“Long read sequencing is waarschijnlijk de beste test voor onopgeloste gevallen met overtuigende varianten in een enkel gen of een duidelijk fenotype,” zei Negi. “Het kan dienen als één enkele diagnostische test, waardoor de noodzaak voor meerdere klinische bezoeken wordt verminderd en een jarenlang diagnostisch traject in een kwestie van uren wordt omgezet.”

Gemiddeld had elke patiënt 280 genen (waaronder enkele genen voor de ziekte van Mendel die geassocieerd zijn met erfelijke ziekten veroorzaakt door mutaties in één gen) met significante eiwitcoderende regio's die duidelijk bedekt worden door lange lezingen en niet gedetecteerd door korte lezingen.

"Er is zoveel meer van het genoom dat de lange lezingen kunnen ontsluiten", zei Negi. "Maar het zal enige tijd duren voordat we deze nieuwe informatie, onthuld door lange lezingen, volledig kunnen interpreteren. Deze gegevens waren niet aanwezig in onze klinische databases. Uitlezingen onthullen ongeveer 5,8% meer van het telomeer-tot-telomeer-genoom waartoe korte lezingen eenvoudigweg geen toegang hadden."

Andere onderzoekers van UC Santa Cruz die bij dit onderzoek betrokken zijn, zijn Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker en Sara O'Rourke.

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door het Chan Zuckerberg Initiative.

Bronnen: