Sist leste sekvensering revolusjonerer diagnostisering av sjeldne sykdommer

Sist leste sekvensering revolusjonerer diagnostisering av sjeldne sykdommer

Én av 10 mennesker over hele verden er rammet av en sjelden genetisk lidelse, men omtrent 50 % av dem forblir udiagnostisert til tross for rask økning i genetisk teknologi og testing. Selv om en person har tilgang til testing, kan diagnoseprosessen ta rundt fem år eller lenger, noe som noen ganger er for sent for pasienter, som ofte er barn, til å starte riktig behandling.

Dette er delvis fordi dagens kliniske testing bruker en metode som kalles kortlest sekvensering, som ikke kan få tilgang til informasjon i visse områder av genomet og derfor ikke kan utføre avgjørende bevis for diagnose. Imidlertid går UC Santa Cruz-forskere videre til en banebrytende alternativ metode, kalt Lonad-sekvensering, som kan gi et mer omfattende datasett for å identifisere variasjoner, eliminere behovet for flere spesialiserte tester og optimere diagnosen av sjeldne sykdommer.

En ny studie viser at sekvensering med lang levetid har potensial til å forbedre diagnosehastigheten samtidig som tiden til diagnose reduseres fra år til dager – i en enkelt test og til en mye lavere kostnad. Studien ble publisert iAmerican Journal of Human Geneticsog ledet av kjernemedlemmer av UCSC Genomic Institute Professor of Biomolecular Engineering (BME) Benedikt Paten og førsteamanuensis i BME Karen Miga, samt tidligere UCSC-postdoktor Jean Monlong.

Sjeldne sykdommer er noe folk har slitt med i så mange år, og hvis vi har sekvenseringsteknologi som optimerer diagnostisk testing, vil det være et stort bidrag – og det er det vi testet som en del av denne artikkelen. "

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, førsteforfatter av oppgaven

"I dag er det diagnostiske utbyttet av genetisk sekvensering frustrerende lavt," sa Paten. "En sannsynlig årsak er de ufullstendige sekvenseringsmetodene, variantene og epigenetiske signalene i vår kohort.

Finn sjeldne sykdommer

Denne studien fokuserte på sjeldne monogene sykdommer forårsaket av en lidelse i et enkelt gen.

Forskere diagnostiserer genetiske sykdommer ved å søke gjennom deres genetiske materiale for å finne varianter - forskjeller i et gen som kan forhindre at det fungerer som det skal. Den typiske tilnærmingen til å finne disse variantene bruker en teknikk som kalles kortlest sekvensering, som kartlegger genetiske basepar - kombinasjoner av adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og tymin (T) - i sekvenser på omtrent 150-250 hver.

Begrensningen med kortlest sekvensering er imidlertid at den kan gå glipp av viktig informasjon i visse regioner av genomet, for eksempel mønstre av basepar som er mye lengre enn bare 250 basepar. Den kan heller ikke utføre «fasing», prosessen med å bestemme hvilke varianter som er arvet fra mor og hvilke som kommer fra far. Dette kan hjelpe klinikere med å oppdage hvilke varianter som er arvet. For eksempel når to varianter er arvet fra samme forelder, en fra hver forelder, eller ikke arves i det hele tatt. Dette kan være svært nyttig informasjon for genetiske diagnoser, spesielt når foreldredata ikke er tilgjengelige.

Derimot kan langvarig sekvensering lese lange strekninger med DNA samtidig, og eliminere hull som kan føre til at forskere og klinikere går glipp av viktig informasjon om genvariasjon. Langlest sekvensering gir også direkte fasedata samt informasjon om metylering, en kjemisk prosess i DNA som gjør at gener "slår av eller på" og kan bidra til sykdom.

"Langvarig sekvensering vil være mye bedre i visse tilfeller, og vi tar skritt for å bevise det," sa Negi.

Leder i metoder

UC Santa Cruz Genomics Institute-forskere har en omfattende historie med innovasjon og ekspertise innen langvarig sekvensering og utvikler aktivt metoder for å optimalisere sekvensering og analyse for et bredt spekter av helseforskningsapplikasjoner. Mange av teknikkene som forskere utviklet for å oppnå prestasjoner, for eksempel det første virkelig komplette "telomere-telomere" referansegenomet, brukes nå for å forbedre pasientresultatene.

"Hvis tidligere funn ble forsterket, fant vi at fordelene ved å bruke langvarig sekvensering ble betydelig økt ved å bruke et komplett, såkalt 'telomere-telomere' referansegenom i stedet for den eksisterende ufullstendige, men mye brukte genomiske referansen," sa MIGA. "Vi forventer at pangenomer - referanser som representerer mangfoldig menneskelig variasjon - vil dra enda mer nytte av nye langlivede sekvenseringsteknologier."

Paten og Migas laboratorier slo seg sammen med klinikere for å jobbe med tilfeller av 42 pasienter med sjeldne sykdommer - noen av dem ble diagnostisert gjennom kortavleste metoder eller andre spesialiserte tester, noen av dem var ennå ikke diagnostisert. I noen tilfeller hadde forskerne tilgang til foreldrenes genetiske informasjon, men i andre hadde de ikke.

Langvarig sekvensering av pasientene ble utført av MIGA-laboratoriet ved bruk av Nanopore-sekvensering, en langvarig sekvenseringsmetode ved UCSC, for å oppnå svært nøyaktige, ende-til-ende-avlesninger av pasientenes genomer for omtrent $1000 per prøve.

De genomiske dataene ble analysert ved hjelp av beregningsmetoder utviklet i Paten-laboratoriet for å finne små og store varianter, fasedata og metyleringsdata, alt ved hjelp av en rørledning kalt NAPU-rørledningen. Analyseprosessen tar omtrent en dag eller mindre, avhengig av hastigheten på databehandlingen, og koster $100.

løse saker

Etter å ha sekvensert og analysert pasientdata, fant forskerne at langlest avlesning ga et mer omfattende datasett sammenlignet med det som kan utledes ved bruk av kortlest sekvensering.

Langavlest sekvensering ga en avgjørende diagnose for 11 av de 42 pasientene i kohorten, og ga alt fra kortavleste data så vel som tilleggsinformasjon inkludert flere sjeldne kandidatvarianter, langdistansefase og metylering - alt i en enkelt, billig og rask protokoll.

De 11 tilfellene som ble diagnostisert inkluderte fire medfødte binyrehypoplasier (en sjelden tilstand der binyrene er forstørret og ikke fungerer som de skal). Genet som er ansvarlig for denne sykdommen er lokalisert i et spesielt utfordrende område av genomet – det kan ikke karakteriseres ved bruk av kortlest sekvenseringsteknologi, og dagens kliniske testing er tungvint og ufullstendig.

"For å løse disse tilfellene har vi utviklet et nytt pan-genomisk verktøy som integrerer nye høykvalitetssammenstillinger som referansegenomet "telomeres-telomeres" nåværende posisjon ved INSERM i Frankrike. "Vi var spente på å se det menneskelige genomet, som historisk sett har vært vanskelig å studere. Resultatene våre oppmuntrer oss til å utvide vår tilnærming til flere sykdommer som lenge har vært stoppet."

I tillegg involverte to tilfeller forstyrrelser i seksuell utvikling, mens et sjeldent tilfelle av Leydig-cellehypoplasi på grunn av underutviklede Leydig-celler i testiklene påvirket mannlig seksuell utvikling. I tillegg har fire tilfeller av nevroutviklingsforstyrrelser, som hver representerer lange og utfordrende diagnostiske odysseyer, endelig blitt løst.

"Langlest sekvensering er sannsynligvis den nest beste testen for uløste tilfeller med overbevisende varianter i et enkelt gen eller en klar fenotype," sa Negi. "Det kan tjene som en enkelt diagnostisk test, redusere behovet for flere kliniske besøk og konvertere en årelang diagnostisk reise til noen timer."

I gjennomsnitt hadde hver pasient 280 gener (inkludert noen gener fra Mendelssykdom assosiert med arvelige sykdommer forårsaket av enkeltgenmutasjoner) med betydelige proteinkodende regioner som er tydelig dekket av lange lesninger og uoppdaget av korte lesninger.

"Det er så mye mer av genomet som lange lesninger kan låse opp," sa Negi. "Men det vil ta tid før vi fullt ut kan tolke denne nye informasjonen avslørt ved lange lesninger. Disse dataene var ikke til stede i våre kliniske databaser. Lesninger avdekker omtrent 5,8 % mer av telomer-til-telomer-genomet som korte lesninger rett og slett ikke kunne få tilgang til."

Andre UC Santa Cruz forskere involvert i denne forskningen inkluderer Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker og Sara O'Rourke.

Denne forskningen ble delvis finansiert av Chan Zuckerberg Initiative.

Kilder: