Secvențierea ultimei citiri revoluționează diagnosticarea bolilor rare

Secvențierea ultimei citiri revoluționează diagnosticarea bolilor rare

Una din 10 persoane din întreaga lume este afectată de o tulburare genetică rară, dar aproximativ 50% dintre ele rămân nediagnosticate, în ciuda creșterii rapide a tehnologiei genetice și a testelor. Chiar dacă o persoană are acces la testare, procesul de diagnosticare poate dura aproximativ cinci ani sau mai mult, ceea ce uneori este prea târziu pentru ca pacienții, care sunt adesea copii, să înceapă tratamentul adecvat.

Acest lucru se datorează parțial pentru că testarea clinică actuală utilizează o metodă numită secvențiere cu citire scurtă, care nu poate accesa informații în anumite regiuni ale genomului și, prin urmare, nu poate realiza dovezi cruciale pentru diagnostic. Cu toate acestea, cercetătorii de la UC Santa Cruz se îndreaptă către o metodă alternativă de ultimă oră, numită secvențiere Lonad, care poate oferi un set de date mai cuprinzător pentru identificarea variațiilor, elimină necesitatea mai multor teste specializate și poate optimiza diagnosticul bolilor rare.

Un nou studiu arată că secvențierea de lungă durată are potențialul de a îmbunătăți ratele de diagnosticare, reducând în același timp timpul până la diagnosticare de la ani la zile - într-un singur test și la un cost mult mai mic. Studiul a fost publicat înJurnalul American de Genetică Umanăși condus de membri de bază ai Institutului Genomic UCSC, profesor de inginerie biomoleculară (BME) Benedikt Paten și profesor asociat al BME Karen Miga, precum și fostul savant postdoctoral UCSC Jean Monlong.

Bolile rare sunt ceva cu care oamenii s-au luptat atât de mulți ani, iar dacă avem tehnologie de secvențiere care optimizează testarea diagnostică, aceasta va fi o contribuție imensă - și asta am testat ca parte a acestei lucrări. „

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, primul autor al lucrării

„Astăzi, randamentul de diagnostic al secvențierii genetice este frustrant de scăzut”, a spus Paten. „O cauză probabilă este metodele de secvențiere incomplete, variantele și semnalele epigenetice din cohorta noastră.

Găsiți boli rare

Acest studiu sa concentrat asupra bolilor monogenice rare cauzate de o tulburare a unei singure gene.

Oamenii de știință diagnostichează bolile genetice căutând prin materialul lor genetic pentru a găsi variante - diferențe într-o genă care o pot împiedica să funcționeze corect. Abordarea tipică pentru găsirea acestor variante folosește o tehnică numită secvențiere cu citire scurtă, care mapează perechile de baze genetice - combinații de adenină (A), citozină (C), guanină (G) și timină (T) - în secvențe de aproximativ 150-250 fiecare.

Cu toate acestea, limitarea secvențierii cu citire scurtă este că poate pierde informații cruciale în anumite regiuni ale genomului, cum ar fi modelele de perechi de baze care sunt mult mai lungi decât doar 250 de perechi de baze. Nici nu poate efectua „phasing”, procesul de determinare care variante sunt moștenite de la mamă și care provin de la tată. Acest lucru îi poate ajuta pe clinicieni să descopere care variante sunt moștenite. De exemplu, când două variante sunt moștenite de la același părinte, câte una de la fiecare părinte, sau nu sunt moștenite deloc. Acestea pot fi informații foarte utile pentru diagnosticele genetice, mai ales atunci când datele parentale nu sunt disponibile.

În schimb, secvențierea cu viață lungă poate citi întinderi lungi de ADN simultan, eliminând golurile care pot determina oamenii de știință și clinicienii să rateze informații importante despre variația genelor. Secvențierea de citire lungă oferă, de asemenea, date directe de fază, precum și informații despre metilare, un proces chimic din ADN care face ca genele să fie „pornite sau oprite” și poate contribui la apariția bolii.

„Secvențierea de lungă durată va fi mult mai bună în anumite cazuri și luăm măsuri pentru a demonstra asta”, a spus Negi.

Plumb în metode

Cercetătorii UC Santa Cruz Genomics Institute au o istorie extinsă de inovare și expertiză în secvențierea de lungă durată și dezvoltă în mod activ metode pentru a optimiza secvențierea și analiza pentru o gamă largă de aplicații de cercetare în domeniul sănătății. Multe dintre tehnicile pe care cercetătorii le-au dezvoltat pentru a obține realizări, cum ar fi primul genom de referință „telomer-telomer” cu adevărat complet, sunt acum folosite pentru a îmbunătăți rezultatele pacientului.

„Dacă descoperirile anterioare au fost consolidate, am constatat că beneficiile utilizării secvențierii de lungă durată au fost semnificativ crescute prin utilizarea unui genom de referință complet, așa-numitul „telomer-telomer” în loc de referința genomică incompletă, dar utilizată pe scară largă”, a spus MIGA. Anticipăm că pangenomurile - referințe care reprezintă variații umane diverse - vor beneficia și mai mult de noile tehnologii de secvențiere cu viață lungă.

Laboratoarele Paten și Miga au făcut echipă cu clinicieni pentru a lucra la cazurile a 42 de pacienți cu boli rare - dintre care unii au fost diagnosticați prin metode de citire scurtă sau alte teste specializate, dintre care unii nu au fost încă diagnosticați. În unele cazuri, cercetătorii au avut acces la informațiile genetice ale părinților, dar în altele nu.

Secvențierea de lungă durată a pacienților a fost efectuată de laboratorul MIGA folosind secvențierea Nanopore, o metodă de secvențiere de lungă durată la UCSC, pentru a obține citiri extrem de precise, de la capăt la capăt, ale genomului pacienților pentru aproximativ 1.000 USD per probă.

Datele genomice au fost analizate folosind metode computaționale dezvoltate în laboratorul Paten pentru a găsi variante mici și mari, date de fază și date de metilare, toate folosind o conductă numită conducta NAPU. Procesul de analiză durează aproximativ o zi sau mai puțin, în funcție de viteza de procesare a computerului, și costă 100 USD.

rezolva cazurile

După secvențierea și analizarea datelor despre pacienți, cercetătorii au descoperit că citirile de lungă durată au oferit un set de date mai cuprinzător în comparație cu ceea ce poate fi derivat folosind secvențierea de citire scurtă.

Secvențierea de citire lungă a oferit un diagnostic concludent pentru 11 dintre cei 42 de pacienți din cohortă, oferind totul, de la datele de citire scurtă, precum și informații suplimentare, inclusiv variante suplimentare rare de candidat, fazare și metilare pe distanță lungă - toate într-un singur protocol, ieftin și rapid.

Cele 11 cazuri diagnosticate au inclus patru hipoplazii suprarenale congenitale (o afecțiune rară în care glandele suprarenale sunt mărite și nu funcționează corect). Gena responsabilă pentru această boală este situată într-o regiune deosebit de provocatoare a genomului - nu poate fi caracterizată folosind tehnologia de secvențiere a citirii scurte, iar testarea clinică actuală este greoaie și incompletă.

„Pentru a rezolva aceste cazuri, am dezvoltat un nou instrument pan-genomic care integrează noi ansambluri de înaltă calitate, cum ar fi poziția actuală a genomului de referință „telomeri-telomeri” la INSERM din Franța. „Am fost încântați să vedem genomul uman, care din punct de vedere istoric a fost dificil de studiat. Rezultatele noastre ne încurajează să ne extindem abordarea la mai multe boli care au fost de mult blocate.”

În plus, două cazuri au implicat tulburări ale dezvoltării sexuale, în timp ce un caz rar de hipoplazie a celulelor Leydig din cauza celulelor Leydig subdezvoltate din testicule a afectat dezvoltarea sexuală masculină. În plus, patru cazuri de tulburări de neurodezvoltare, fiecare reprezentând odisee diagnostică lungă și provocatoare, au fost în sfârșit rezolvate.

„Secvențierea de citit lung este probabil următorul cel mai bun test pentru cazurile nerezolvate cu variante convingătoare într-o singură genă sau un fenotip clar”, a spus Negi. „Poate servi ca un singur test de diagnostic, reducând nevoia de vizite clinice multiple și transformând o călătorie de diagnosticare de ani de zile într-o chestiune de ore.”

În medie, fiecare pacient a avut 280 de gene (inclusiv unele gene ale bolii mendeliane asociate cu boli moștenite cauzate de mutații ale unei singure gene) cu regiuni semnificative de codificare a proteinelor care sunt în mod clar acoperite de citiri lungi și nedetectate de citiri scurte.

„Există mult mai mult din genom, încât citirile lungi pot debloca”, a spus Negi. „Dar va dura timp până să putem interpreta pe deplin această nouă informație dezvăluită prin citiri lungi. Aceste date nu au fost prezente în bazele noastre de date clinice. Citirile descoperă cu aproximativ 5,8% mai mult din genomul telomer-la-telomer pe care citirile scurte pur și simplu nu l-au putut accesa”.

Alți cercetători UC Santa Cruz implicați în această cercetare includ Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker și Sara O’Rourke.

Această cercetare a fost finanțată parțial de Chan Zuckerberg Initiative.

Surse: