Sekvenovanie posledného čítania prináša revolúciu v diagnostike zriedkavých chorôb

Sekvenovanie posledného čítania prináša revolúciu v diagnostike zriedkavých chorôb

Jeden z 10 ľudí na celom svete je postihnutý zriedkavou genetickou poruchou, ale asi 50 % z nich zostáva nediagnostikovaných napriek rýchlemu nárastu genetickej technológie a testovania. Aj keď má osoba prístup k testovaniu, proces diagnostiky môže trvať približne päť rokov alebo dlhšie, čo je niekedy príliš neskoro na to, aby pacienti, ktorými sú často deti, začali so správnou liečbou.

Je to čiastočne preto, že súčasné klinické testovanie používa metódu nazývanú sekvenovanie krátkeho čítania, ktoré nemá prístup k informáciám v určitých oblastiach genómu, a preto nemôže vykonať rozhodujúci dôkaz pre diagnózu. Výskumníci UC Santa Cruz však postupujú vpred k špičkovej alternatívnej metóde nazývanej Lonad sekvenovanie, ktorá môže poskytnúť komplexnejší súbor údajov na identifikáciu variácií, eliminovať potrebu viacerých špecializovaných testov a optimalizovať diagnostiku zriedkavých chorôb.

Nová štúdia ukazuje, že dlhodobé sekvenovanie má potenciál zlepšiť mieru diagnostiky a zároveň skrátiť čas na diagnostiku z rokov na dni – v jedinom teste a za oveľa nižšie náklady. Štúdia bola publikovaná v rAmerican Journal of Human Geneticsa viedli ho kľúčoví členovia Genomického inštitútu UCSC, profesor biomolekulového inžinierstva (BME) Benedikt Paten a docentka BME Karen Miga, ako aj bývalý postdoktorand UCSC Jean Monlong.

Zriedkavé choroby sú niečím, s čím ľudia zápasili toľko rokov, a ak máme technológiu sekvenovania, ktorá optimalizuje diagnostické testovanie, bude to obrovský prínos – a práve to sme testovali v rámci tohto dokumentu. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. študent, prvý autor príspevku

"Dnes je diagnostický výťažok genetického sekvenovania frustrujúco nízky," povedal Paten. "Pravdepodobnou príčinou sú neúplné sekvenčné metódy, varianty a epigenetické signály v našej kohorte.

Nájdite zriedkavé choroby

Táto štúdia sa zamerala na zriedkavé monogénne ochorenia spôsobené poruchou jedného génu.

Vedci diagnostikujú genetické choroby prehľadávaním ich genetického materiálu, aby našli varianty – rozdiely v géne, ktoré mu môžu brániť v správnom fungovaní. Typický prístup k nájdeniu týchto variantov využíva techniku ​​nazývanú sekvenovanie krátkeho čítania, ktoré mapuje páry genetických báz – kombinácie adenínu (A), cytozínu (C), guanínu (G) a tymínu (T) – v sekvenciách po približne 150-250.

Obmedzením krátkeho sekvenovania však môže chýbať zásadná informácia v určitých oblastiach genómu, ako sú vzory párov báz, ktoré sú oveľa dlhšie ako len 250 párov báz. Nemôže ani vykonávať „fázovanie“, proces určovania, ktoré varianty sú zdedené od matky a ktoré pochádzajú od otca. To môže pomôcť lekárom zistiť, ktoré varianty sú zdedené. Napríklad, keď sa dva varianty zdedia od toho istého rodiča, jeden od každého rodiča alebo sa nededia vôbec. To môže byť veľmi užitočná informácia pre genetické diagnózy, najmä ak nie sú k dispozícii údaje od rodičov.

Na rozdiel od toho, sekvenovanie s dlhou životnosťou môže čítať dlhé úseky DNA súčasne, čím sa eliminujú medzery, ktoré môžu spôsobiť, že vedci a lekári vynechajú dôležité informácie o variáciách génov. Sekvenovanie s dlhým čítaním tiež poskytuje priame údaje o fáze, ako aj informácie o metylácii, chemickom procese v DNA, ktorý spôsobuje „zapnutie alebo vypnutie“ génov a môže prispieť k ochoreniu.

"Dlhodobé sekvenovanie bude v určitých prípadoch oveľa lepšie a podnikáme kroky, aby sme to dokázali," povedal Negi.

Olovo v metódach

Výskumní pracovníci UC Santa Cruz Genomics Institute majú rozsiahlu históriu inovácií a odborných znalostí v oblasti dlhodobého sekvenovania a aktívne vyvíjajú metódy na optimalizáciu sekvenovania a analýzy pre širokú škálu aplikácií v oblasti zdravotného výskumu. Mnohé z techník, ktoré výskumníci vyvinuli na dosiahnutie úspechov, ako napríklad prvý skutočne kompletný referenčný genóm „teloméra-teloméra“, sa teraz používajú na zlepšenie výsledkov pacientov.

"Ak boli predchádzajúce zistenia posilnené, zistili sme, že výhody používania dlhodobého sekvenovania sa výrazne zvýšili použitím úplného, ​​takzvaného "telomérovo-telomérového" referenčného genómu namiesto existujúceho neúplného, ​​ale široko používaného genómového odkazu, " povedal MIGA. "Očakávame, že pangenómy - referencie predstavujúce rozmanité ľudské variácie - budú mať ešte väčší úžitok z nových technológií sekvenovania s dlhou životnosťou."

Laboratóriá spoločnosti Paten a Miga sa spojili s klinickými lekármi, aby pracovali na prípadoch 42 pacientov so zriedkavými chorobami – niektorí z nich boli diagnostikovaní pomocou krátkych metód alebo iných špecializovaných testov, pričom niektorí ešte neboli diagnostikovaní. V niektorých prípadoch mali výskumníci prístup ku genetickým informáciám rodičov, v iných nie.

Laboratórium MIGA vykonalo dlhodobé sekvenovanie pacientov pomocou sekvenovania Nanopore, metódy dlhodobého sekvenovania v UCSC, aby sa dosiahlo vysoko presné čítanie genómov pacientov od konca do konca za približne 1 000 USD za vzorku.

Genomické údaje boli analyzované pomocou výpočtových metód vyvinutých v laboratóriu Paten, aby sa našli malé a veľké varianty, údaje o fázach a údaje o metylácii, všetko pomocou potrubia nazývaného NAPU potrubie. Proces analýzy trvá približne jeden deň alebo menej v závislosti od rýchlosti počítačového spracovania a stojí 100 USD.

riešiť prípady

Po sekvenovaní a analýze údajov o pacientoch výskumníci zistili, že dlhodobé čítania poskytujú komplexnejší súbor údajov v porovnaní s tým, čo možno odvodiť pomocou sekvenovania krátkeho čítania.

Sekvenovanie s dlhým čítaním poskytlo presvedčivú diagnózu pre 11 zo 42 pacientov v kohorte, pričom poskytlo všetko od krátkych údajov, ako aj ďalšie informácie vrátane ďalších zriedkavých kandidátskych variantov, fázovania na dlhé vzdialenosti a metylácie - všetko v jedinom, lacnom a rýchlom protokole.

11 diagnostikovaných prípadov zahŕňalo štyri vrodené hypoplázie nadobličiek (zriedkavý stav, pri ktorom sú nadobličky zväčšené a nefungujú správne). Gén zodpovedný za toto ochorenie sa nachádza v obzvlášť náročnej oblasti genómu – nemožno ho charakterizovať pomocou technológie krátkeho čítania a súčasné klinické testovanie je ťažkopádne a neúplné.

"Na vyriešenie týchto prípadov sme vyvinuli nový pan-genomický nástroj, ktorý integruje nové vysokokvalitné zostavy, ako je súčasná pozícia referenčného genómu "telomeres-telomeres" v INSERM vo Francúzsku. "Boli sme nadšení, keď sme videli ľudský genóm, ktorý bolo historicky ťažké študovať. Naše výsledky nás povzbudzujú, aby sme rozšírili náš prístup k viacerým chorobám, ktoré boli dlho pozastavené."

Okrem toho dva prípady zahŕňali poruchy sexuálneho vývoja, zatiaľ čo zriedkavý prípad hypoplázie Leydigových buniek v dôsledku nedostatočne vyvinutých Leydigových buniek v semenníkoch ovplyvnil mužský sexuálny vývoj. Okrem toho boli konečne vyriešené štyri prípady neurovývojových porúch, z ktorých každý predstavuje dlhé a náročné diagnostické odysey.

"Sekvenovanie dlhého čítania je pravdepodobne ďalším najlepším testom pre nevyriešené prípady s presvedčivými variantmi v jedinom géne alebo jasným fenotypom," povedal Negi. "Môže slúžiť ako jediný diagnostický test, čím sa zníži potreba viacerých klinických návštev a premení sa roky trvajúca diagnostická cesta na niekoľko hodín."

V priemere mal každý pacient 280 génov (vrátane niektorých génov Mendelovej choroby spojených s dedičnými chorobami spôsobenými mutáciami jedného génu) s významnými oblasťami kódovania proteínov, ktoré sú jasne pokryté dlhými čítaniami a nie sú detekované krátkymi čítaniami.

"Je toho oveľa viac z genómu, že dlhé čítania môžu odomknúť," povedal Negi. "Bude však chvíľu trvať, kým budeme môcť plne interpretovať tieto nové informácie odhalené dlhými čítaniami. Tieto údaje neboli prítomné v našich klinických databázach. Čítania odhalia približne o 5,8 % viac genómu telomér na teloméru, ku ktorému sa krátke čítanie jednoducho nedostalo."

Ďalší výskumníci z UC Santa Cruz zapojení do tohto výskumu zahŕňajú Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker a Sara O'Rourke.

Tento výskum bol čiastočne financovaný iniciatívou Chan Zuckerberg.

Zdroje: