Zaporedje zadnjega branja revolucionira diagnozo redkih bolezni

Zaporedje zadnjega branja revolucionira diagnozo redkih bolezni

Enega od 10 ljudi po vsem svetu prizadene redka genetska motnja, vendar jih približno 50 % ostane nediagnosticiranih kljub hitremu porastu genetske tehnologije in testiranja. Tudi če ima oseba dostop do testiranja, lahko postopek diagnoze traja okoli pet let ali več, kar je včasih prepozno, da bi bolniki, ki so pogosto otroci, začeli ustrezno zdravljenje.

To je delno zato, ker trenutno klinično testiranje uporablja metodo, imenovano sekvenciranje kratkega branja, ki ne more dostopati do informacij v določenih regijah genoma in zato ne more izvesti ključnih dokazov za diagnozo. Vendar se raziskovalci UC Santa Cruz premikajo naprej k vrhunski alternativni metodi, imenovani sekvenciranje Lonad, ki lahko zagotovi bolj celovit nabor podatkov za prepoznavanje variacij, odpravi potrebo po več specializiranih testih in optimizira diagnozo redkih bolezni.

Nova študija kaže, da ima dolgoživo sekvenciranje potencial za izboljšanje stopnje diagnoze, hkrati pa skrajša čas do diagnoze z let na dneve – v enem samem testu in po veliko nižji ceni. Študija je bila objavljena vAmerican Journal of Human Geneticsvodijo pa ga osrednji člani profesorja biomolekularnega inženirstva (BME) Benedikt Paten in izredna profesorica BME Karen Miga ter nekdanji podoktorski učenjak UCSC Genomic Institute Jean Monlong.

Redke bolezni so nekaj, s čimer se ljudje borijo že toliko let, in če imamo tehnologijo sekvenciranja, ki optimizira diagnostično testiranje, bo to ogromen prispevek – in to je tisto, kar smo preizkusili kot del tega prispevka. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. študent, prvi avtor prispevka

"Danes je diagnostični izkoristek genetskega sekvenciranja frustrirajoče nizek," je dejal Paten. »Verjeten vzrok so nepopolne metode sekvenciranja, različice in epigenetski signali v naši kohorti.

Poiščite redke bolezni

Ta študija se je osredotočila na redke monogene bolezni, ki jih povzroča motnja enega samega gena.

Znanstveniki diagnosticirajo genetske bolezni z iskanjem po njihovem genetskem materialu, da bi našli različice – razlike v genu, ki lahko preprečijo njegovo pravilno delovanje. Tipičen pristop k iskanju teh različic uporablja tehniko, imenovano sekvenciranje kratkega branja, ki preslika genetske bazne pare – kombinacije adenina (A), citozina (C), gvanina (G) in timina (T) – v zaporedjih po približno 150–250.

Vendar pa je omejitev sekvenciranja kratkega branja ta, da lahko zgreši ključne informacije v določenih regijah genoma, kot so vzorci baznih parov, ki so veliko daljši od samo 250 baznih parov. Prav tako ne more izvajati "stopenj", postopka določanja, katere različice so podedovane od matere in katere prihajajo od očeta. To lahko klinikom pomaga odkriti, katere različice so podedovane. Na primer, ko sta dve različici podedovani od istega starša, ena od vsakega starša ali pa sploh nista podedovani. To je lahko zelo koristna informacija za genetske diagnoze, zlasti kadar podatki o starših niso na voljo.

Nasprotno pa lahko dolgoživo sekvenciranje bere dolge odseke DNK hkrati, s čimer se odpravijo vrzeli, zaradi katerih lahko znanstveniki in kliniki spregledajo pomembne informacije o variacijah genov. Sekvenciranje z dolgim ​​branjem zagotavlja tudi neposredne fazne podatke in informacije o metilaciji, kemičnem procesu v DNK, ki povzroči, da se geni »vklopijo ali izklopijo« in lahko prispeva k bolezni.

"Dolgoživo sekvenciranje bo v nekaterih primerih veliko boljše in delamo korake, da to dokažemo," je dejal Negi.

Vodenje v metodah

Raziskovalci inštituta za genomiko UC Santa Cruz imajo obsežno zgodovino inovacij in strokovnega znanja na področju dolgoživega zaporedja ter aktivno razvijajo metode za optimizacijo zaporedja in analize za širok spekter aplikacij zdravstvenih raziskav. Številne tehnike, ki so jih raziskovalci razvili za doseganje dosežkov, kot je prvi resnično popolni referenčni genom "telomera-telomera", se zdaj uporabljajo za izboljšanje rezultatov bolnikov.

"Če so bile prejšnje ugotovitve okrepljene, smo ugotovili, da so bile koristi uporabe dolgoživega sekvenciranja znatno povečane z uporabo popolnega, tako imenovanega referenčnega genoma 'telomera-telomera' namesto obstoječe nepopolne, a široko uporabljene genomske reference," je dejal MIGA. "Predvidevamo, da bodo pangenomi - reference, ki predstavljajo raznolike človeške variacije - še bolj imeli koristi od novih dolgoživih tehnologij zaporedja."

Laboratoriji Paten in Miga so se združili s kliničnimi zdravniki, da bi delali na primerih 42 bolnikov z redkimi boleznimi – pri nekaterih so bile diagnoze postavljene z metodami kratkega branja ali drugimi specializiranimi testi, pri nekaterih pa diagnoza še ni bila postavljena. V nekaterih primerih so raziskovalci imeli dostop do genetskih informacij staršev, v drugih pa ne.

Dolgoživo sekvenciranje bolnikov je izvedel laboratorij MIGA z uporabo Nanopore sekvenciranja, metode dolgoživega sekvenciranja na UCSC, da bi dosegli zelo natančne odčitke bolnikovih genomov od konca do konca za približno 1000 $ na vzorec.

Genomski podatki so bili analizirani z računalniškimi metodami, razvitimi v laboratoriju Paten, da bi našli majhne in velike različice, fazne podatke in podatke o metilaciji, vse z uporabo cevovoda, imenovanega cevovod NAPU. Postopek analize traja približno en dan ali manj, odvisno od hitrosti računalniške obdelave, in stane 100 USD.

reševanje primerov

Po določanju zaporedja in analizi podatkov o pacientih so raziskovalci ugotovili, da odčitki z dolgim ​​branjem zagotavljajo celovitejši nabor podatkov v primerjavi s tistimi, ki jih je mogoče pridobiti s sekvenciranjem s kratkim branjem.

Sekvenciranje dolgega branja je zagotovilo dokončno diagnozo za 11 od 42 bolnikov v kohorti, pri čemer je zagotovilo vse, od podatkov kratkega branja, pa tudi dodatne informacije, vključno z dodatnimi redkimi različicami kandidatov, faziranjem na dolge razdalje in metilacijo – vse v enem samem, poceni in hitrem protokolu.

11 diagnosticiranih primerov je vključevalo štiri prirojene hipoplazije nadledvične žleze (redko stanje, pri katerem so nadledvične žleze povečane in ne delujejo pravilno). Gen, ki je odgovoren za to bolezen, se nahaja v posebej zahtevnem delu genoma – ni ga mogoče opisati s tehnologijo sekvenciranja kratkega branja, trenutno klinično testiranje pa je okorno in nepopolno.

»Za rešitev teh primerov smo razvili novo pangenomsko orodje, ki združuje nove visokokakovostne sklope, kot je trenutni položaj referenčnega genoma »telomeri-telomeri« na INSERM v Franciji. »Navdušeni smo bili, ko smo videli človeški genom, ki ga je bilo v preteklosti težko preučevati. Naši rezultati nas spodbujajo k razširitvi našega pristopa na več bolezni, ki so že dolgo zastale."

Poleg tega sta dva primera vključevala motnje spolnega razvoja, medtem ko je redek primer hipoplazije Leydigovih celic zaradi nerazvitih Leydigovih celic v modih vplival na spolni razvoj moškega. Poleg tega so bili končno razrešeni štirje primeri nevrorazvojnih motenj, od katerih je vsak predstavljal dolgo in zahtevno diagnostično odisejado.

"Dolgo branje zaporedja je verjetno naslednji najboljši test za nerešene primere s prepričljivimi različicami v enem samem genu ali jasnim fenotipom," je dejal Negi. "Lahko služi kot en sam diagnostični test, kar zmanjša potrebo po večkratnih kliničnih obiskih in pretvori dolgoletno diagnostično potovanje v nekaj ur."

V povprečju je imel vsak bolnik 280 genov (vključno z nekaterimi geni Mendelove bolezni, povezanimi z dednimi boleznimi, ki jih povzročajo posamezne genske mutacije) s pomembnimi proteinskimi kodirnimi regijami, ki so jasno pokrite z dolgimi odčitki in niso zaznane pri kratkih odčitkih.

"Genoma je toliko več, da ga lahko odklenejo dolga branja," je dejal Negi. "Toda trajalo bo nekaj časa, preden bomo lahko v celoti interpretirali te nove informacije, ki so jih razkrili dolgi odčitki. Ti podatki niso bili prisotni v naših kliničnih podatkovnih zbirkah. Odčitki odkrijejo približno 5,8 % več genoma telomera do telomera, do katerega kratki odčitki preprosto niso mogli dostopati."

Drugi raziskovalci UC Santa Cruz, vključeni v to raziskavo, so Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker in Sara O'Rourke.

To raziskavo je delno financirala pobuda Chan Zuckerberg.

Viri: