Senast lästa sekvensering revolutionerar diagnosen av sällsynta sjukdomar

Senast lästa sekvensering revolutionerar diagnosen av sällsynta sjukdomar

En av tio personer i världen drabbas av en sällsynt genetisk sjukdom, men cirka 50 % av dem förblir odiagnostiserade trots snabba ökningar av genetisk teknik och testning. Även om en person har tillgång till tester, kan diagnosprocessen ta cirka fem år eller längre, vilket ibland är för sent för patienter, som ofta är barn, att påbörja korrekt behandling.

Detta beror delvis på att nuvarande kliniska tester använder en metod som kallas kortläst sekvensering, som inte kan komma åt information i vissa regioner av genomet och därför inte kan utföra avgörande bevis för diagnos. Men UC Santa Cruz forskare går vidare till en banbrytande alternativ metod, kallad Lonad-sekvensering, som kan ge en mer omfattande datauppsättning för att identifiera variationer, eliminera behovet av flera specialiserade tester och optimera diagnosen av sällsynta sjukdomar.

En ny studie visar att långlivad sekvensering har potentialen att förbättra diagnosfrekvensen samtidigt som den minskar tiden till diagnos från år till dagar - i ett enda test och till en mycket lägre kostnad. Studien publicerades iAmerican Journal of Human Geneticsoch leds av kärnmedlemmar i UCSC Genomic Institute Professor of Biomolecular Engineering (BME) Benedikt Paten och docent i BME Karen Miga, samt tidigare UCSC-postdoktor Jean Monlong.

Sällsynta sjukdomar är något som människor har kämpat med i så många år, och om vi har sekvenseringsteknik som optimerar diagnostiska tester, kommer det att vara ett enormt bidrag – och det är vad vi testade som en del av denna uppsats. "

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, första författare av tidningen

"Idag är det diagnostiska utbytet av genetisk sekvensering frustrerande lågt", säger Paten. "En trolig orsak är ofullständiga sekvenseringsmetoder, varianter och epigenetiska signaler i vår kohort.

Hitta sällsynta sjukdomar

Denna studie fokuserade på sällsynta monogena sjukdomar orsakade av en störning i en enda gen.

Forskare diagnostiserar genetiska sjukdomar genom att söka igenom deras genetiska material för att hitta varianter - skillnader i en gen som kan hindra den från att fungera korrekt. Den typiska metoden för att hitta dessa varianter använder en teknik som kallas kortläst sekvensering, som kartlägger genetiska baspar - kombinationer av adenin (A), cytosin (C), guanin (G) och tymin (T) - i sekvenser på cirka 150-250 vardera.

Begränsningen med kortläst sekvensering är dock att den kan missa avgörande information i vissa regioner av genomet, såsom mönster av baspar som är mycket längre än bara 250 baspar. Det kan inte heller utföra "fasning", processen att avgöra vilka varianter som ärvs från modern och vilka som kommer från fadern. Detta kan hjälpa läkare att upptäcka vilka varianter som ärvs. Till exempel när två varianter ärvs från samma förälder, en från varje förälder eller inte ärvs alls. Detta kan vara mycket användbar information för genetiska diagnoser, särskilt när föräldradata inte är tillgängliga.

Däremot kan långlivad sekvensering läsa långa sträckor av DNA samtidigt, vilket eliminerar luckor som kan få forskare och läkare att missa viktig information om genvariation. Långläst sekvensering ger också direkta fasdata samt information om metylering, en kemisk process i DNA som gör att gener "slår på eller av" och kan bidra till sjukdomar.

"Långlivad sekvensering kommer att bli mycket bättre i vissa fall, och vi vidtar åtgärder för att bevisa det," sa Negi.

Leda i metoder

Forskare från UC Santa Cruz Genomics Institute har en omfattande historia av innovation och expertis inom långlivad sekvensering och utvecklar aktivt metoder för att optimera sekvensering och analys för ett brett spektrum av hälsoforskningstillämpningar. Många av de tekniker som forskare utvecklat för att uppnå prestationer, som det första riktigt kompletta "telomer-telomer"-referensgenomet, används nu för att förbättra patienternas resultat.

"Om tidigare fynd förstärktes, fann vi att fördelarna med att använda långlivad sekvensering avsevärt ökade genom att använda ett komplett, så kallat "telomere-telomere" referensgenom istället för den befintliga ofullständiga men allmänt använda genomiska referensen," sa MIGA. "Vi räknar med att pangenomer - referenser som representerar olika mänskliga variationer - kommer att dra ännu mer nytta av nya långlivade sekvenseringsteknologier."

Paten och Migas laboratorier samarbetade med kliniker för att arbeta med fall av 42 patienter med sällsynta sjukdomar - av vilka några diagnostiserades genom kortlästa metoder eller andra specialiserade tester, av vilka några ännu inte hade diagnostiserats. I vissa fall hade forskare tillgång till föräldrars genetiska information, men i andra inte.

Långlivad sekvensering av patienterna utfördes av MIGA-laboratoriet med hjälp av Nanopore-sekvensering, en långlivad sekvenseringsmetod vid UCSC, för att uppnå mycket exakta, end-to-end-avläsningar av patienternas genom för cirka 1 000 USD per prov.

Genomiska data analyserades med hjälp av beräkningsmetoder utvecklade i Paten-laboratoriet för att hitta små och stora varianter, fasdata och metyleringsdata, allt med hjälp av en pipeline som kallas NAPU-pipeline. Analysprocessen tar ungefär en dag eller mindre, beroende på hastigheten på datorbehandlingen, och kostar $100.

lösa fall

Efter sekvensering och analys av patientdata fann forskarna att långläsningsavläsningar gav en mer omfattande datamängd jämfört med vad som kan härledas med kortläst sekvensering.

Långläst sekvensering gav en avgörande diagnos för 11 av de 42 patienterna i kohorten, vilket gav allt från kortlästa data såväl som ytterligare information inklusive ytterligare sällsynta kandidatvarianter, långvägsfasning och metylering - allt i ett enda, billigt och snabbt protokoll.

De 11 fallen som diagnostiserades inkluderade fyra medfödda binjurehypoplasier (ett sällsynt tillstånd där binjurarna är förstorade och inte fungerar korrekt). Genen som är ansvarig för denna sjukdom är belägen i en särskilt utmanande region av genomet – den kan inte karakteriseras med hjälp av kortläst sekvenseringsteknik, och nuvarande kliniska tester är besvärliga och ofullständiga.

"För att lösa dessa fall har vi utvecklat ett nytt pan-genomiskt verktyg som integrerar nya högkvalitativa sammansättningar som referensgenomet "telomeres-telomeres" nuvarande position på INSERM i Frankrike. "Vi var glada över att se det mänskliga genomet, som historiskt har varit svårt att studera. Våra resultat uppmuntrar oss att utöka vår strategi för fler sjukdomar som länge har stannat upp."

Dessutom involverade två fall störningar i sexuell utveckling, medan ett sällsynt fall av Leydig-cellshypoplasi på grund av underutvecklade Leydig-celler i testiklarna påverkade manlig sexuell utveckling. Dessutom har fyra fall av neuroutvecklingsstörningar, som vart och ett representerar långa och utmanande diagnostiska odysséer, äntligen lösts.

"Långläst sekvensering är förmodligen det näst bästa testet för olösta fall med övertygande varianter i en enda gen eller en tydlig fenotyp," sa Negi. "Det kan fungera som ett enda diagnostiskt test, vilket minskar behovet av flera kliniska besök och omvandlar en år lång diagnostisk resa till några timmar."

I genomsnitt hade varje patient 280 gener (inklusive några gener från Mendelsjukan associerade med ärftliga sjukdomar orsakade av enstaka genmutationer) med betydande proteinkodande regioner som tydligt täcks av långa läsningar och oupptäckta av korta läsningar.

"Det finns så mycket mer av genomet som de långa läsningarna kan låsa upp," sa Negi. "Men det kommer att ta tid innan vi fullt ut kan tolka denna nya information som avslöjats av långa läsningar. Dessa data fanns inte i våra kliniska databaser. Läsningar avslöjar cirka 5,8 % mer av telomer-till-telomer-genomet som korta läsningar helt enkelt inte kunde komma åt."

Andra UC Santa Cruz-forskare som är involverade i denna forskning inkluderar Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker och Sara O’Rourke.

Denna forskning finansierades delvis av Chan Zuckerberg Initiative.

Källor: