Neue CRISPR-angereicherte Metagenomikmethode zum Nachweis von Antibiotika-Resistenzgenen in Abwasser

Antibiotikaresistenz ist ein globales Anliegen, das unsere Fähigkeit bedroht, bakterielle Infektionen beim Menschen und Tieren zu verhindern und zu behandeln. Um die Entstehung und Ausbreitung von Resistenz besser zu überwachen, entwickelten Forscher des Carl R. Woese Institute for Genomic Biology eine mit CRISPR angereicherte Metagenomikmethode zur verstärkten Überwachung von Antibiotika-Resistenzgenen, Argumentation, in Abwasser.

Während Antibiotika starke moderne Werkzeuge zur Bekämpfung von Infektionen sind, verändern sich die Bakterien und passen sich im Laufe der Zeit als Reaktion auf die Exposition gegenüber Antibiotika an und verringern daher die Wirksamkeit. Weit verbreitete Überbeanspruchung und Missbrauch von Antibiotika in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie beschleunigen dieses Problem weiter.

Über die direkte Exposition gegenüber Antibiotika hinaus wird auch die Resistenz zwischen verschiedenen Bakterien durch die Übertragung kleiner Stücke bakterieller DNA übertragen, die als Antibiotikaresistenzgene bezeichnet werden. Es gibt über 5000 identifizierte Argumente, und diese Gene finden sich in klinischen Proben sowie in Wasserkörpern, die aus Krankenhäusern, Farmen und Abwassersystemen stammen.

Args können die lebensrettende Kraft von Medikamenten verringern, die zur Behandlung von Bakterieninfektionen eingesetzt werden. Die Erkennung von Argumenten mit klinischer Bedeutung ermöglicht es den Behörden und Ärzten im Bereich der klinischen Bedeutung, zu antizipieren, was in Gemeinden zirkuliert. „

Helen Nguyen (IGOH), Professor für Zivil- und Umweltingenieurwesen, Universität von Illinois Urbana-Champaign

Abwasser enthält zahlreiche verschiedene Argumente, die mit genetischem Material aus verschiedenen Quellen gemischt sind, einschließlich Menschen, Viren und Bakterien. Da Args nur einen winzigen Prozentsatz des gesamten DNA -Gehalts ausmachen, erfordert die Aufdeckung in Abwasserproben empfindliche Erkennungsmethoden. Die häufigste Technik ist die quantitative Polymerasekettenreaktion qPCR. Diese Methode verwendet RNA -Guides, die als Primer bezeichnet werden, um die spezifischen DNA -Sequenzen bekannter Argumente zu identifizieren, die dann zur Nachweis verstärkt werden.

„QPCR ist eine sensible Methode, für die viele Menschen in der öffentlichen Gesundheit gut ausgebildet sind, aber es erfordert Primer -Design und -validierung, die sehr zeitaufwändig ist“, sagte Yuqing Mao, ein Doktorand in Zivil- und Umweltingenieurwesen, der Erstautor auf dem Papier war. „Da QPCR verwendet wird, um gezielte Gensequenzen herauszuziehen, bleibt das gesamte andere genetische Material in der Probe völlig unbekannt.“

Die zweite Methode, die Metagenomik, ist nicht so empfindlich wie qPCR, erfasst jedoch eine vollständigere Geschichte der genetischen Informationen, die in einer Stichprobe enthalten sind. Die Metagenomik beinhaltet das Aufbrechen aller Proben -DNA in Millionen kleinerer Fragmente, die gleichzeitig mit Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation sequenziert werden. Computeralgorithmen passen die vollständigen DNA -Sequenzen zum Vergleich mit Datenbanken zusammen, um ihre Identität zu bestimmen.

„Args sind in der Stichprobe weniger als ein Prozent an 0,1 % der DNA noch näher an 0,1 % der DNA. Durch die Verwendung von Standardmethoden mit Metagenomik sind 99,9 % der nachgewiesenen DNA nicht mit den Argumenten verbunden“, sagte Mao.

Um die Menge an arg-assoziierten Fragmenten in den Proben zu bereichern, nutzten Mao, Nguyen und ihr Mitarbeiter, Joanna Shisler, der mit der Abteilung für Mikrobiologie in Illinois verbunden ist, das CRISPR-Cas9-System-ein hochwirksames Instrument für die Gen-Bearbeitung. Die DNA ist an zufälligen Stellen fragmentiert, wenn sie Standardmethogenomik-Methoden verwenden, aber die Einbindung von cripsr-cas9 ermöglicht eine gezielte Fragmentierung innerhalb der Argumente. Durch die Gestaltung eines Pools von 6010 verschiedenen Leitfaden -RNAs, die spezifisch an DNA an verschiedenen Stellen binden können, die in den Argumenten gefunden wurden, könnte das Cas9 -Protein an diesen Stellen geschnitten werden.

„Unsere neue CRISPR -Methode erhöht die Häufigkeit von Arg -Fragmenten in der Stichprobe, wodurch ihre Chancen erhöht werden, dass sie gelesen und nachgewiesen werden. CRISPR hat auch ein besseres Potenzial für Multiplex -Assays als für PCR, da die molekulare Wechselwirkung für CRISPR einfach und unkompliziert ist“, sagte Mao.

Ihre neue Methode senkte die Erkennungsgrenze von Argumenten um eine Größenordnung von 10-4 auf 10-5 im Vergleich zur Standardmetagenomik und fand 1189 weitere Argumente und 61 weitere Arg-Familien, die in Abwasserproben nur geringer Häufigkeit haben.

Als Doktorand des sechsten Jahrs baute Mao dieses Projekt von Grund auf, die wissenschaftlichen Hindernisse aufzubauen und viele neue Techniken auf dem Weg zu lernen. Sie sagte: „Als ich das erste Mal die Sequenzierungsergebnisse erzielte, habe ich nie erwartet, wie viel sensibler es mit der regulären Methode verglichen werden würde. Es erkannte viele weitere Argumente als wir dachten. Nachdem ich das Projekt beendet hatte, habe ich das Gefühl, aufgewachsen zu sein.“

Aber während diese Arbeit abgeschlossen ist, verfolgen Mao und Nguyen bereits mehrere neue Richtungen, einschließlich der Erweiterung der Anwendungen ihrer metagenomischen CRISPR-Cas9-Methode auf ein breiteres Spektrum von Umweltproben und die Verwendung ihrer Ergebnisse, um die Gestaltung neuer QPCR-Primer zu leiten.

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