Хистонова мимикрия от SARS-CoV-2 протеина нарушава епигенетичната регулация на клетките-гостоприемници

Хистонова мимикрия от SARS-CoV-2 протеина нарушава епигенетичната регулация на клетките-гостоприемници

В скорошно проучване, публикувано в Природата Изследователите показаха, че протеин от коронавирус 2 на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV-2) действа като мимик на хистони, за да наруши епигенетичната регулация на клетките гостоприемници.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Настоящите доказателства сочат, че инфекцията със SARS-CoV-2 потиска вродените имунни отговори и нарушава епигенетичната регулация. Как обаче става това остава неизвестно. В редки случаи други вирулентни вируси могат да повлияят на епигенетичната регулация чрез имитиране на протеини на гостоприемника, особено хистони. Хистоните пакетират ДНК в сложни структури и регулират достъпа до генома.

Хистоните са обект на спектър от пост-транслационни модификации (PTM), които са динамично регулирани, за да контролират генната експресия. Хистонова мимикрия позволява на вирусите да нарушат способността на клетките да реагират на инфекция и да регулират генната експресия. Въпреки това мимикрията на хистони от коронавируси (CoV) все още не е валидирана.

Проучването и резултатите

Настоящото проучване изследва дали SARS-CoV-2 използва мимикрия на хистони, за да повлияе на регулирането на хроматина и отговора на инфекцията. Първо, изследователите проведоха биоинформативно сравнение на SARS-CoV-2 протеини с човешки хистони. Имаше идентично съвпадение на шест остатъка между аминокиселини 50-55 на отворена четяща рамка 8 (ORF8) и критичните региони в N-края на H3 хистона.

Тези остатъци лежат в неподреден регион на повърхността на мономерния ORF8. Интересното е, че ARKS последователността е открита в този мотив, който присъства на две различни места в H3 опашката. Протеомната характеристика разкрива, че ДНК метилтрансфераза 1 (DNMT1) е свързващият партньор на ORF8.

След това беше изследвана вътреклетъчната локализация на ORF8, за да се определи дали функционира като мимик на хистон. HEK293T клетки бяха трансфектирани с Strep-маркирана конструкция, кодираща ORF8, която беше визуализирана с помощта на флуоресцентна сонда. Имунофлуоресценцията показва, че ORF8 обикновено е локализиран в цитоплазмата и ядрената периферия.

Клетъчното фракциониране обаче показа, че той се намира както в ядрото, така и в цитоплазмата. В допълнение, екипът установи, че ORF8 е колокализиран с ламини B1 и A/C в трансфектирани клетки. Моделът на експресия беше потвърден в клетъчна линия A549, заразена със SARS-CoV-2, експресираща ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (ACE2). След това се оценява свързването на хроматин, като се използват нарастващи концентрации на сол. ORF8 се дисоциира от хроматиновата фракция при подобни концентрации на сол като ламини и хистони.

За разлика от това, изтриването на ARKSAP мотива в ORF8 (ORF8ΔARKSAP) даде възможност за дисоциация при по-ниски концентрации на сол, което предполага, че предполагаемият хистонов мимичен мотив влияе върху силата на асоцииране между ORF8 и хроматина. Имунопреципитацията на хроматин със секвениране (ChIP-seq) демонстрира обогатяването на ORF8 в специфични геномни региони, особено тези, свързани с модификацията H3K27me3.

Установено е също, че ORF8 се свързва с лизин ацетилтрансфераза 2А (KAT2A). ORF8ΔARKSAP не е свързан с хроматинови протеини, което предполага, че ARKSAP мотивът засилва асоциирането на ORF8 с хроматиновите протеини. Беше извършен целеви масов спектрометричен анализ, за ​​да се изследва дали хистоновото имитиращо място е модифицирано подобно на хистоните. Това идентифицира остатък от лизин в предложеното мимическо място, което е ацетилирано подобно на H3 хистон.

Освен това, експресията на ORF8 причинява значително намаляване на изобилието на KAT2A, докато протеините на ядрената ламина и свързаните с ламината нива на хетерохроматин остават непроменени или се повишават леко. След това екипът наблюдава, че хистоновите PTMs, свързани с транскрипционната репресия, са увеличени в трансфектирани HEK293T клетки, експресиращи ORF8, докато тези, свързани с активна генна експресия, са изчерпани. По-специално, тези в ARKS мотива на H3 бяха силно разрушени.

Анализът на достъпен за транспозаза хроматин, използващ секвениране с висока производителност, показа, че ORF8 намалява достъпността на хроматина, но не и ORF8ΔARKSAP. Беше извършено секвениране на РНК, за да се определят диференциално експресирани гени (DEG) в трансфектирани клетки. ORF8 и ORF8ΔARKSAP споделят подгрупа от DEG, но присъствието на хистонов мимичен мотив води до по-малко динамични промени в генната експресия.

Гените, които са били регулирани надолу в отговор на ORF8 в сравнение с ORF8ΔARKSAP, имат по-добра достъпност на хроматина и по-високи базални нива на H3K9ac модификация, отколкото регулираните гени. След това беше генериран мутантен SARS-CoV-2 без ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); A549ACE2 клетки бяха заразени с този мутант или SARS-CoV-2, за да се сравнят нивата на вирусния геном и производството на вирусни частици.

Нямаше разлики в титрите на вируса или броя на копията на генома на 24-ия час и само незначителни промени бяха очевидни на 48-ия час. Инфекцията със SARS-CoV-2 причини силно увеличение на репресивните хистонови PTM (H3K9me3 и H3K27me3). Обратно, този ефект беше отслабен в отсъствието на ORF8.

По-нататъшни експерименти с мутантен SARS-CoV-2, в който ARKSAP мотивът беше изтрит от ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP), показаха значително отслабване на ефектите от инфекцията върху H3K9ac и достъпността на хроматина, възпроизвеждайки ефектите от делецията на ORF8. Инфекцията с див тип SARS-CoV-2 намалява експресията на KAT2A, докато инфекцията със SARS-CoV-2ΔARKSAP или SARS-CoV-2ΔORF8 не.

И накрая, получените от индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPSC) белодробни алвеоларни клетки тип II (iAT2) бяха заразени с див тип и мутантни SARS-CoV-2 клетки. Броят на копията на генома на мутантните вируси е намален 48 часа след инфекцията, което предполага, че ORF8, особено мотивът ARKSAP, засяга репликацията на вируса. Вирусните частици, произведени от ΔORF8 мутанта, са по-малко от тези на вируса от див тип. За разлика от това, мутантът ΔARKSAP изглежда подобен на див тип SARS-CoV-2, което предполага, че ORF8 има независима от ARKSAP функция за генериране на вирусни частици.

Изводи

Проучването показа, че ORF8 на SARS-CoV-2 съдържа ARKS мотив и че експресията на ORF8 нарушава регулацията на хистоновите PTM. Изследователите откриха връзката на ORF8 с протеини, свързани с хроматин, ядрена ламина и хистони. Подобно на хистоните, ORF8 претърпява ацетилиране в рамките на хистоновия мимичен мотив.

Делецията на ORF8 доведе до намаляване на вирусната репликация в iAT2 клетки, докато броят на копията на вирусния геном беше изрично повлиян от загубата на хистонов мимичен мотив. Като цяло изследователите идентифицираха нов случай на мимикрия на хистони по време на инфекция със SARS-CoV-2 и описаха механизми, чрез които вирусът нарушава регулацията на хроматина в клетката гостоприемник.

Справка:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z