Mimikry histonů proteinem SARS-CoV-2 narušují epigenetickou regulaci hostitelských buněk

Mimikry histonů proteinem SARS-CoV-2 narušují epigenetickou regulaci hostitelských buněk

V nedávné studii publikované v Příroda Výzkumníci prokázali, že protein koronaviru 2 (SARS-CoV-2) těžkého akutního respiračního syndromu působí jako napodobenina histonu k narušení epigenetické regulace hostitelských buněk.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Současné důkazy naznačují, že infekce SARS-CoV-2 potlačuje vrozené imunitní reakce a narušuje epigenetickou regulaci. Jak se to stane, však zůstává neznámé. Ve vzácných případech mohou jiné virulentní viry interferovat s epigenetickou regulací napodobováním hostitelských proteinů, zejména histonů. Histony sbalují DNA do složitých struktur a regulují přístup ke genomu.

Histony podléhají spektru posttranslačních modifikací (PTM), které jsou dynamicky regulovány pro kontrolu genové exprese. Mimikry histonů umožňují virům narušit schopnost buněk reagovat na infekci a regulovat genovou expresi. Nicméně mimikry histonů koronaviry (CoV) dosud nebyly ověřeny.

Studie a výsledky

Tato studie zkoumala, zda SARS-CoV-2 využívá mimikry histonů k ovlivnění regulace chromatinu a infekční reakce. Nejprve vědci provedli bioinformatické srovnání proteinů SARS-CoV-2 s lidskými histony. Mezi aminokyselinami 50–55 otevřeného čtecího rámce 8 (ORF8) a kritickými oblastmi na N-konci histonu H3 byla identická shoda šesti zbytků.

Tyto zbytky leží v neuspořádané oblasti na povrchu monomerního ORF8. Je zajímavé, že v tomto motivu byla nalezena sekvence ARKS, která je přítomna na dvou různých místech v ocasu H3. Proteomická charakterizace odhalila, že DNA methyltransferáza 1 (DNMT1) je vazebným partnerem ORF8.

Dále byla zkoumána intracelulární lokalizace ORF8, aby se určilo, zda funguje jako mimika histonu. Buňky HEK293T byly transfekovány konstruktem značeným Strep kódujícím ORF8, který byl vizualizován pomocí fluorescenční sondy. Imunofluorescence ukázala, že ORF8 byl typicky lokalizován v cytoplazmě a jaderné periferii.

Nicméně frakcionace buněk ukázala, že se nachází jak v jádře, tak v cytoplazmě. Kromě toho tým zjistil, že ORF8 se v transfekovaných buňkách kolokalizoval s laminy B1 a A/C. Vzor exprese byl potvrzen v buněčné linii A549 infikované SARS-CoV-2 exprimující angiotensin-konvertující enzym 2 (ACE2). Dále byla hodnocena vazba chromatinu pomocí zvyšujících se koncentrací soli. ORF8 disocioval z chromatinové frakce při podobných koncentracích soli jako laminy a histony.

Na rozdíl od toho delece motivu ARKSAP v ORF8 (ORF8AARKSAP) umožnila disociaci při nižších koncentracích soli, což naznačuje, že domnělý motiv mimického histonu ovlivňuje sílu asociace mezi ORF8 a chromatinem. Imunoprecipitace chromatinu se sekvenováním (ChIP-seq) prokázala obohacení ORF8 ve specifických genomových oblastech, zejména těch, které jsou spojeny s modifikací H3K27me3.

Bylo také zjištěno, že ORF8 asociuje s lysinacetyltransferázou 2A (KAT2A). ORF8AARKSAP nebyl spojen s chromatinovými proteiny, což naznačuje, že motiv ARKSAP zvyšuje asociaci ORF8 s chromatinovými proteiny. Byla provedena cílená hmotnostní spektrometrická analýza, aby se zjistilo, zda je histonové mimické místo modifikováno podobně jako histony. To identifikovalo lysinový zbytek v navrhovaném mimickém místě, který byl acetylován podobně jako histon H3.

Kromě toho exprese ORF8 způsobila významný pokles množství KAT2A, zatímco proteiny jaderné laminy a hladiny heterochromatinu asociovaného s laminou zůstaly nezměněny nebo mírně vzrostly. Dále tým pozoroval, že histonové PTM spojené s represí transkripce byly zvýšeny v transfekovaných buňkách HEK293T exprimujících ORF8, zatímco ty spojené s aktivní genovou expresí byly vyčerpány. Zejména ty v motivu ARKS H3 byly vysoce narušeny.

Test chromatinu přístupného transpozázou s použitím vysoce výkonného sekvenování ukázal, že ORF8 snížil dostupnost chromatinu, ale ne ORF8AARKSAP. Bylo provedeno sekvenování RNA, aby se definovaly odlišně exprimované geny (DEG) v transfekovaných buňkách. ORF8 a ORF8AARKSAP sdílely podskupinu DEG, ale přítomnost histonového mimického motivu vedla k méně dynamickým změnám v genové expresi.

Geny, které byly downregulovány v reakci na ORF8 ve srovnání s ORF8AARKSAP, měly lepší dostupnost chromatinu a vyšší bazální hladiny modifikace H3K9ac než upregulované geny. Dále byl vytvořen mutant SARS-CoV-2 postrádající ORF8 (SARS-CoV-2AORF8); Buňky A549ACE2 byly infikovány tímto mutantem nebo SARS-CoV-2, aby se porovnaly hladiny virového genomu a produkce virových částic.

Po 24 hodinách nebyly žádné rozdíly v titrech viru nebo počtu kopií genomu a po 48 hodinách byly patrné pouze malé změny. Infekce SARS-CoV-2 způsobila silný nárůst represivních histonových PTM (H3K9me3 a H3K27me3). Naopak, tento účinek byl zeslaben v nepřítomnosti ORF8.

Další experimenty s mutantem SARS-CoV-2, ve kterém byl motiv ARKSAP vymazán z ORF8 (SARS-CoV-2AARKSAP), ukázaly významné zeslabení účinků infekce na dostupnost H3K9ac a chromatinu, replikující účinky delece ORF8. Infekce SARS-CoV-2 divokého typu snížila expresi KAT2A, zatímco infekce SARS-CoV-2AARKSAP nebo SARS-CoV-2AORF8 nikoli.

Nakonec byly plicní alveolární buňky typu II (iAT2) odvozené z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) infikovány buňkami SARS-CoV-2 divokého typu a mutantními buňkami. Počet kopií genomu mutantních virů byl snížen 48 hodin po infekci, což naznačuje, že ORF8, zejména motiv ARKSAP, ovlivňuje replikaci viru. Virové částice produkované mutantem AORF8 bylo méně než u viru divokého typu. Naproti tomu mutant ΔARKSAP se zdál být podobný SARS-CoV-2 divokého typu, což naznačuje, že ORF8 má na ARKSAP nezávislou funkci tvorby virových částic.

Závěry

Studie ukázala, že ORF8 SARS-CoV-2 obsahuje motiv ARKS a že exprese ORF8 narušuje regulaci histonových PTM. Vědci zjistili asociaci ORF8 s proteiny spojenými s chromatinem, jadernou laminou a histony. Podobně jako histony, ORF8 podléhá acetylaci v motivu mimického histonu.

Delece ORF8 vedla ke snížení replikace viru v iAT2 buňkách, zatímco počet kopií virového genomu byl explicitně ovlivněn ztrátou histonového mimického motivu. Celkově výzkumníci identifikovali nový případ mimikry histonů během infekce SARS-CoV-2 a popsali mechanismy, kterými virus narušuje regulaci chromatinu hostitelské buňky.

Odkaz:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z