La imitación de histonas por parte de la proteína SARS-CoV-2 altera la regulación epigenética de las células huésped

La imitación de histonas por parte de la proteína SARS-CoV-2 altera la regulación epigenética de las células huésped

En un estudio reciente publicado en Naturaleza Los investigadores demostraron que una proteína del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática actúa como un imitador de histonas para alterar la regulación epigenética de las células huésped.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

La evidencia actual sugiere que la infección por SARS-CoV-2 suprime las respuestas inmunes innatas y altera la regulación epigenética. Sin embargo, aún se desconoce cómo sucede esto. En casos raros, otros virus virulentos pueden interferir con la regulación epigenética al imitar las proteínas del huésped, en particular las histonas. Las histonas empaquetan el ADN en estructuras complejas y regulan el acceso al genoma.

Las histonas están sujetas a un espectro de modificaciones postraduccionales (PTM) que se regulan dinámicamente para controlar la expresión genética. El mimetismo de histonas permite a los virus alterar la capacidad de las células para responder a la infección y regular la expresión genética. Sin embargo, la imitación de histonas por parte de los coronavirus (CoV) aún no ha sido validada.

El estudio y los resultados.

El presente estudio investigó si el SARS-CoV-2 emplea el mimetismo de histonas para afectar la regulación de la cromatina y la respuesta a la infección. Primero, los investigadores realizaron una comparación bioinformática de las proteínas del SARS-CoV-2 con histonas humanas. Hubo una coincidencia idéntica de seis residuos entre los aminoácidos 50 a 55 del marco de lectura abierto 8 (ORF8) y las regiones críticas en el extremo N de la histona H3.

Estos residuos se encuentran en una región desordenada en la superficie del ORF8 monomérico. Curiosamente, la secuencia ARKS se encontró dentro de este motivo, que está presente en dos ubicaciones diferentes en la cola H3. La caracterización proteómica reveló que la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) es la pareja de unión de ORF8.

A continuación, se examinó la localización intracelular de ORF8 para determinar si funciona como un imitador de histonas. Se transfectaron células HEK293T con una construcción marcada con Strep que codifica ORF8, que se visualizó utilizando una sonda fluorescente. La inmunofluorescencia mostró que ORF8 se localizaba típicamente en el citoplasma y la periferia nuclear.

Sin embargo, el fraccionamiento celular demostró que se localizaba tanto en el núcleo como en el citoplasma. Además, el equipo descubrió que ORF8 se colocalizaba con las láminas B1 y A/C en las células transfectadas. El patrón de expresión se confirmó en la línea celular A549 infectada con SARS-CoV-2 que expresa la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). A continuación, se evaluó la unión a la cromatina utilizando concentraciones de sal crecientes. ORF8 se disocia de la fracción de cromatina en concentraciones de sal similares a las de las láminas y las histonas.

Por el contrario, la eliminación del motivo ARKSAP en ORF8 (ORF8ΔARKSAP) permitió la disociación en concentraciones de sal más bajas, lo que sugiere que el supuesto motivo imitador de histonas influye en la fuerza de asociación entre ORF8 y la cromatina. La inmunoprecipitación de cromatina con secuenciación (ChIP-seq) demostró el enriquecimiento de ORF8 dentro de regiones genómicas específicas, particularmente aquellas asociadas con la modificación H3K27me3.

También se encontró que ORF8 se asocia con la lisina acetiltransferasa 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP no se asoció con las proteínas de la cromatina, lo que sugiere que el motivo ARKSAP mejora la asociación de ORF8 con las proteínas de la cromatina. Se realizó un análisis espectrométrico de masas dirigido para investigar si el sitio imitador de histonas se modifica de manera similar a las histonas. Esto identificó un residuo de lisina en el sitio imitador propuesto que se acetiló de manera similar a la histona H3.

Además, la expresión de ORF8 provocó una disminución significativa en la abundancia de KAT2A, mientras que las proteínas de la lámina nuclear y los niveles de heterocromatina asociada a la lámina permanecieron sin cambios o aumentaron ligeramente. A continuación, el equipo observó que los PTM de histonas asociados con la represión transcripcional aumentaban en las células HEK293T transfectadas que expresaban ORF8, mientras que los asociados con la expresión génica activa se agotaban. En particular, aquellos dentro del motivo ARKS de H3 estaban muy alterados.

El ensayo de cromatina accesible a transposasa mediante secuenciación de alto rendimiento mostró que ORF8 disminuyó la accesibilidad a la cromatina, pero no ORF8ΔARKSAP. Se realizó la secuenciación de ARN para definir genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en células transfectadas. ORF8 y ORF8ΔARKSAP compartieron un subconjunto de DEG, pero la presencia del motivo imitador de histonas resultó en cambios menos dinámicos en la expresión génica.

Los genes que estaban regulados negativamente en respuesta a ORF8 en comparación con ORF8ΔARKSAP tenían una mejor accesibilidad a la cromatina y niveles basales más altos de modificación de H3K9ac que los genes regulados positivamente. A continuación, se generó un SARS-CoV-2 mutante que carecía de ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Se infectaron células A549ACE2 con este mutante o SARS-CoV-2 para comparar los niveles del genoma viral y la producción de partículas virales.

No hubo diferencias en los títulos de virus ni en el número de copias del genoma a las 24 horas, y sólo fueron evidentes cambios menores a las 48 horas. La infección por SARS-CoV-2 provocó un fuerte aumento de PTM de histonas represivas (H3K9me3 y H3K27me3). Por el contrario, este efecto se atenuó en ausencia de ORF8.

Experimentos adicionales con un SARS-CoV-2 mutante en el que se eliminó el motivo ARKSAP de ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) mostraron una atenuación significativa de los efectos de la infección sobre H3K9ac y la accesibilidad a la cromatina, replicando los efectos de la eliminación de ORF8. La infección con SARS-CoV-2 de tipo salvaje redujo la expresión de KAT2A, mientras que la infección por SARS-CoV-2ΔARKSAP o SARS-CoV-2ΔORF8 no lo hizo.

Finalmente, se infectaron células alveolares de pulmón tipo II (iAT2) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) con células de SARS-CoV-2 de tipo salvaje y mutantes. El número de copias del genoma de los virus mutantes se redujo 48 horas después de la infección, lo que sugiere que ORF8, en particular el motivo ARKSAP, afecta la replicación del virus. Las partículas de virus producidas por el mutante ΔORF8 eran menores que las del virus de tipo salvaje. Por el contrario, el mutante ΔARKSAP parecía ser similar al SARS-CoV-2 de tipo salvaje, lo que sugiere que ORF8 tiene una función de generación de partículas virales independiente de ARKSAP.

Conclusiones

El estudio demostró que ORF8 del SARS-CoV-2 contiene un motivo ARKS y que la expresión de ORF8 altera la regulación de las histonas PTM. Los investigadores encontraron la asociación de ORF8 con proteínas asociadas a la cromatina, lámina nuclear e histonas. Al igual que las histonas, ORF8 sufre acetilación dentro del motivo imitador de histonas.

La eliminación de ORF8 dio como resultado una reducción en la replicación del virus en las células iAT2, mientras que el número de copias del genoma viral se vio afectado explícitamente por la pérdida del motivo imitador de histonas. En general, los investigadores identificaron un nuevo caso de mimetismo de histonas durante la infección por SARS-CoV-2 y describieron los mecanismos por los cuales el virus altera la regulación de la cromatina de la célula huésped.

Referencia:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z