SARS-CoV-2 valgu histooni matkimine häirib peremeesrakkude epigeneetilist regulatsiooni

SARS-CoV-2 valgu histooni matkimine häirib peremeesrakkude epigeneetilist regulatsiooni

aastal avaldatud hiljutises uuringus Loodus Teadlased näitasid, et raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) valk toimib histooni jäljendajana, mis häirib peremeesrakkude epigeneetilist regulatsiooni.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Praegused tõendid näitavad, et SARS-CoV-2 nakatumine pärsib kaasasündinud immuunvastuseid ja häirib epigeneetilist regulatsiooni. Kuidas see aga juhtub, jääb teadmata. Harvadel juhtudel võivad teised virulentsed viirused häirida epigeneetilist regulatsiooni, matkides peremeesvalke, eriti histoone. Histoonid pakendavad DNA keerukatesse struktuuridesse ja reguleerivad juurdepääsu genoomile.

Histoonid alluvad translatsioonijärgsete modifikatsioonide (PTM) spektrile, mida geeniekspressiooni kontrollimiseks reguleeritakse dünaamiliselt. Histooni matkimine võimaldab viirustel häirida rakkude võimet reageerida infektsioonile ja reguleerida geeniekspressiooni. Sellegipoolest ei ole koronaviiruste (CoV-de) histooni matkimist veel kinnitatud.

Uuring ja tulemused

Käesolevas uuringus uuriti, kas SARS-CoV-2 kasutab kromatiini regulatsiooni ja infektsioonireaktsiooni mõjutamiseks histooni matkimist. Esiteks viisid teadlased läbi SARS-CoV-2 valkude bioinformaatika võrdluse inimese histoonidega. Avatud lugemisraami 8 (ORF8) aminohapete 50–55 ja H3 histooni N-otsa kriitiliste piirkondade vahel oli identne kuue jäägi vaste.

Need jäägid asuvad monomeerse ORF8 pinna korrastamata piirkonnas. Huvitaval kombel leiti selle motiivi seest ARKS-i järjestus, mis asub H3 sabas kahes erinevas kohas. Proteoomiline iseloomustus näitas, et DNA metüültransferaas 1 (DNMT1) on ORF8 sidumispartner.

Järgmisena uuriti ORF8 rakusisest lokaliseerimist, et teha kindlaks, kas see toimib histooni jäljendajana. HEK293T rakud transfekteeriti ORF8 kodeeriva Strep-märgistatud konstruktiga, mis visualiseeriti fluorestsentssondi abil. Immunofluorestsents näitas, et ORF8 paiknes tavaliselt tsütoplasmas ja tuuma perifeerias.

Rakkude fraktsioneerimine näitas aga, et see paiknes nii tuumas kui ka tsütoplasmas. Lisaks leidis meeskond, et ORF8 kolokaliseerus transfekteeritud rakkudes lamiinidega B1 ja A / C. Ekspressioonimuster kinnitati SARS-CoV-2-ga nakatunud A549 rakuliinis, mis ekspresseerib angiotensiini konverteerivat ensüümi 2 (ACE2). Järgmisena hinnati kromatiini seondumist, kasutades suurenevaid soolakontsentratsioone. ORF8 dissotsieerus kromatiini fraktsioonist sarnaste soolade kontsentratsioonide juures nagu laminaadid ja histoonid.

Seevastu ARKSAP-i motiivi kustutamine ORF8-s (ORF8ΔARKSAP) võimaldas dissotsiatsiooni madalamatel soolakontsentratsioonidel, mis viitab sellele, et oletatav histooni matkiv motiiv mõjutab ORF8 ja kromatiini seose tugevust. Kromatiini immunosadestamine koos sekveneerimisega (ChIP-seq) näitas ORF8 rikastumist spetsiifilistes genoomsetes piirkondades, eriti neis, mis on seotud H3K27me3 modifikatsiooniga.

Samuti leiti, et ORF8 seostub lüsiini atsetüültransferaasiga 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP ei olnud seotud kromatiini valkudega, mis viitab sellele, et ARKSAP motiiv suurendab ORF8 seost kromatiini valkudega. Viidi läbi sihipärane massispektromeetriline analüüs, et uurida, kas histooni jäljendavat kohta muudetakse sarnaselt histoonidega. See tuvastas kavandatud matkimissaidis lüsiinijäägi, mis atsetüüliti sarnaselt H3 histooniga.

Lisaks põhjustas ORF8 ekspressioon KAT2A arvukuse olulist vähenemist, samas kui tuuma lamina valgud ja lamina-seotud heterokromatiini tasemed jäid muutumatuks või tõusid veidi. Järgmisena täheldas meeskond, et transkriptsioonilise repressiooniga seotud histooni PTM-id suurenesid transfekteeritud HEK293T rakkudes, mis ekspresseerivad ORF8, samas kui aktiivse geeniekspressiooniga seotud rakkudes oli ammendunud. Eelkõige olid H3 ARKS-i motiivis olevad väga häiritud.

Suure läbilaskevõimega sekveneerimist kasutav transposaasile ligipääsetav kromatiini test näitas, et ORF8 vähendas kromatiini ligipääsetavust, kuid mitte ORF8AARKSAP. RNA sekveneerimine viidi läbi, et määratleda erinevalt ekspresseeritud geenid (DEG-d) transfekteeritud rakkudes. ORF8 ja ORF8ΔARKSAP jagasid DEG-de alamhulka, kuid histooni matkiva motiivi olemasolu põhjustas geeniekspressioonis vähem dünaamilisi muutusi.

Geenidel, mis olid vastuseks ORF8-le allareguleeritud, võrreldes ORF8AARKSAP-iga, oli parem kromatiini juurdepääsetavus ja kõrgem H3K9ac modifikatsiooni põhitase kui ülesreguleeritud geenidel. Järgmisena loodi mutant SARS-CoV-2, millel puudus ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); A549ACE2 rakud nakatati selle mutandi või SARS-CoV-2-ga, et võrrelda viiruse genoomi taset ja viirusosakeste tootmist.

Viiruse tiitrites ega genoomi koopiate arvus 24 tunni pärast erinevusi ei olnud ja 48 tunni pärast ilmnesid vaid väikesed muutused. SARS-CoV-2 infektsioon põhjustas repressiivsete histooni PTM-ide (H3K9me3 ja H3K27me3) tugeva tõusu. Vastupidi, see efekt nõrgenes ORF8 puudumisel.

Edasised katsed mutantse SARS-CoV-2-ga, milles ARKSAP-i motiiv ORF8-st (SARS-CoV-2AARKSAP) kustutati, näitasid infektsiooni mõju olulist nõrgenemist H3K9ac-le ja kromatiini kättesaadavusele, kordades ORF8 deletsiooni mõju. Nakatumine metsiktüüpi SARS-CoV-2-ga vähendas KAT2A ekspressiooni, samas kui SARS-CoV-2ΔARKSAP või SARS-CoV-2ΔORF8 infektsioon mitte.

Lõpuks nakatati indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (iPSC) pärinevad II tüüpi kopsualveolaarrakud (iAT2) metsiktüüpi ja mutantsete SARS-CoV-2 rakkudega. Mutantsete viiruste genoomi koopiate arv vähenes 48 tundi pärast nakatumist, mis viitab sellele, et ORF8, eriti ARKSAP-i motiiv, mõjutab viiruse replikatsiooni. ΔORF8 mutandi toodetud viirusosakesi oli vähem kui metsiktüüpi viirusel. Seevastu ΔARKSAP mutant näis olevat sarnane metsiktüüpi SARS-CoV-2-ga, mis viitab sellele, et ORF8-l on viirusosakeste genereerimisel ARKSAP-ist sõltumatu funktsioon.

Järeldused

Uuring näitas, et SARS-CoV-2 ORF8 sisaldab ARKS-i motiivi ja et ORF8 ekspressioon häirib histooni PTM-ide regulatsiooni. Teadlased leidsid ORF8 seose kromatiiniga seotud valkude, tuumalamina ja histoonidega. Sarnaselt histoonidega läbib ORF8 atsetüülimise histooni matkiva motiivi sees.

ORF8 kustutamine põhjustas viiruse replikatsiooni vähenemise iAT2 rakkudes, samas kui viiruse genoomi koopiate arvu mõjutas selgesõnaliselt histooni matkiva motiivi kadu. Üldiselt tuvastasid teadlased SARS-CoV-2 nakkuse ajal uue histooni mimikri juhtumi ja kirjeldasid mehhanisme, mille abil viirus häirib peremeesraku kromatiini regulatsiooni.

Viide:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z