SARS-CoV-2-proteiinin histonimimikri häiritsee isäntäsolujen epigeneettistä säätelyä

SARS-CoV-2-proteiinin histonimimikri häiritsee isäntäsolujen epigeneettistä säätelyä

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa Luonto Tutkijat osoittivat, että vakava akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2) -proteiini toimii histonimimiikinä ja häiritsee isäntäsolujen epigeneettistä säätelyä.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Nykyiset todisteet viittaavat siihen, että SARS-CoV-2-infektio vaimentaa synnynnäisiä immuunivasteita ja häiritsee epigeneettistä säätelyä. Kuinka tämä tapahtuu, on kuitenkin epäselvä. Harvinaisissa tapauksissa muut virulentit virukset voivat häiritä epigeneettistä säätelyä matkimalla isäntäproteiineja, erityisesti histoneita. Histonit pakkaavat DNA:ta monimutkaisiin rakenteisiin ja säätelevät pääsyä genomiin.

Histonit ovat alttiita monille post-translationaalisille modifikaatioille (PTM), joita säädellään dynaamisesti geeniekspression säätelemiseksi. Histonimimikri antaa viruksille mahdollisuuden häiritä solujen kykyä reagoida infektioon ja säädellä geeniekspressiota. Koronavirusten (CoV:t) histonimimikriä ei kuitenkaan ole vielä validoitu.

Tutkimus ja tulokset

Tässä tutkimuksessa tutkittiin, käyttääkö SARS-CoV-2 histonimimikriä vaikuttamaan kromatiinin säätelyyn ja infektiovasteeseen. Ensin tutkijat suorittivat SARS-CoV-2-proteiinien bioinformatiikan vertailun ihmisen histoneihin. Avoimen lukukehyksen 8 (ORF8) aminohappojen 50–55 ja H3-histonin N-pään kriittisten alueiden välillä oli identtinen kuuden tähteen yhteensopivuus.

Nämä tähteet sijaitsevat epäjärjestyneellä alueella monomeerisen ORF8:n pinnalla. Mielenkiintoista on, että ARKS-sekvenssi löydettiin tästä motiivista, joka on läsnä kahdessa eri paikassa H3-hännän. Proteominen karakterisointi paljasti, että DNA-metyylitransferaasi 1 (DNMT1) on ORF8:n sitoutumiskumppani.

Seuraavaksi tutkittiin ORF8:n solunsisäistä sijaintia sen määrittämiseksi, toimiiko se histonimimiikinä. HEK293T-solut transfektoitiin ORF8:aa koodaavalla Strep-merkityllä konstruktilla, joka visualisoitiin käyttämällä fluoresoivaa koetinta. Immunofluoresenssi osoitti, että ORF8 oli tyypillisesti paikantunut sytoplasmaan ja tuman reuna-alueille.

Solujen fraktiointi osoitti kuitenkin, että se sijaitsi sekä tumassa että sytoplasmassa. Lisäksi ryhmä havaitsi, että ORF8 kolokalisoitui laminien B1 ja A/C kanssa transfektoiduissa soluissa. Ilmentymismalli vahvistettiin SARS-CoV-2:lla infektoidussa A549-solulinjassa, joka ekspressoi angiotensiiniä konvertoivaa entsyymiä 2 (ACE2). Seuraavaksi kromatiinin sitoutuminen arvioitiin käyttämällä kasvavia suolapitoisuuksia. ORF8 dissosioitui kromatiinifraktiosta samanlaisilla suolapitoisuuksilla kuin laminit ja histonit.

Sitä vastoin ARKSAP-motiivin deleetio ORF8:ssa (ORF8AARKSAP) mahdollisti dissosioitumisen pienemmillä suolapitoisuuksilla, mikä viittaa siihen, että oletettu histonin jäljitelmämotiivi vaikuttaa ORF8:n ja kromatiinin välisen assosiaatiovoimakkuuteen. Kromatiini-immunosaostus sekvensoinnilla (ChIP-seq) osoitti ORF8:n rikastumisen spesifisillä genomialueilla, erityisesti niillä, jotka liittyvät H3K27me3-modifikaatioon.

ORF8:n havaittiin myös assosioituvan lysiiniasetyylitransferaasi 2A:n (KAT2A) kanssa. ORF8AARKSAP ei liittynyt kromatiiniproteiineihin, mikä viittaa siihen, että ARKSAP-motiivi lisää ORF8:n assosiaatiota kromatiiniproteiineihin. Kohdennettu massaspektrometrianalyysi suoritettiin sen tutkimiseksi, onko histonin jäljitelmäkohta modifioitunut samalla tavalla kuin histonit. Tämä identifioi ehdotetussa jäljitelmäkohdassa lysiinitähteen, joka asetyloitiin samalla tavalla kuin H3-histoni.

Lisäksi ORF8:n ilmentyminen aiheutti merkittävän laskun KAT2A:n runsaudessa, kun taas tuman laminaproteiinit ja laminaan liittyvät heterokromatiinitasot pysyivät muuttumattomina tai nousivat hieman. Seuraavaksi ryhmä havaitsi, että transkription repressioon liittyvät histoni-PTM:t lisääntyivät transfektoiduissa HEK293T-soluissa, jotka ekspressoivat ORF8:aa, kun taas aktiiviseen geeniekspressioon liittyvät PTM:t olivat ehtyneet. Erityisesti H3:n ARKS-aiheeseen kuuluvat olivat erittäin häiriintyneitä.

Transposaasin käytettävissä oleva kromatiinimääritys, jossa käytettiin korkean suorituskyvyn sekvensointia, osoitti, että ORF8 vähensi kromatiinin saatavuutta, mutta ei ORF8AARKSAP. RNA-sekvensointi suoritettiin differentiaalisesti ekspressoituneiden geenien (DEG:iden) määrittämiseksi transfektoiduissa soluissa. ORF8:lla ja ORF8AARKSAP:lla oli yhteinen DEG:ien osajoukko, mutta histonijäljitelmämotiivin läsnäolo johti vähemmän dynaamisiin muutoksiin geeniekspressiossa.

Geeneillä, joita säädeltiin alas vastauksena ORF8:aan verrattuna ORF8AARKSAP:iin, oli parempi kromatiinin saatavuus ja korkeammat H3K9ac-modifikaatioiden perustasot kuin ylössäädellyillä geeneillä. Seuraavaksi luotiin mutantti SARS-CoV-2, josta puuttui ORF8 (SARS-CoV-2AORF8); A549ACE2-solut infektoitiin tällä mutantilla tai SARS-CoV-2:lla viruksen genomitasojen ja viruspartikkelien tuotannon vertaamiseksi.

Virustiittereissä tai genomin kopiomäärässä ei ollut eroja 24 tunnin kohdalla, ja vain vähäisiä muutoksia havaittiin 48 tunnin kohdalla. SARS-CoV-2-infektio aiheutti voimakkaan kasvun repressiivisissä histoni-PTM:issä (H3K9me3 ja H3K27me3). Sitä vastoin tämä vaikutus heikkeni ORF8:n puuttuessa.

Lisäkokeet SARS-CoV-2-mutantilla, joissa ARKSAP-motiivi poistettiin ORF8:sta (SARS-CoV-2AARKSAP), osoittivat infektion vaikutusten merkittävää heikkenemistä H3K9ac:iin ja kromatiinin saatavuuteen, mikä toisti ORF8-deleetion vaikutukset. Villityypin SARS-CoV-2-infektio vähensi KAT2A:n ilmentymistä, kun taas SARS-CoV-2AARKSAP- tai SARS-CoV-2ΔORF8-infektio ei.

Lopuksi indusoidut pluripotentit kantasolut (iPSC) -peräiset tyypin II keuhkojen alveolaariset solut (iAT2) infektoitiin villityypin ja mutantti SARS-CoV-2 -soluilla. Mutanttivirusten genomikopiomäärä väheni 48 tuntia infektion jälkeen, mikä viittaa siihen, että ORF8, erityisesti ARKSAP-motiivi, vaikuttaa viruksen replikaatioon. ΔORF8-mutantin tuottamia viruspartikkeleita oli vähemmän kuin villityypin viruksen hiukkasia. Sitä vastoin ΔARKSAP-mutantti näytti olevan samanlainen kuin villityypin SARS-CoV-2, mikä viittaa siihen, että ORF8:lla on ARKSAP-riippumaton viruspartikkelien muodostustoiminto.

Johtopäätökset

Tutkimus osoitti, että SARS-CoV-2:n ORF8 sisältää ARKS-motiivin ja että ORF8:n ilmentyminen häiritsee histoni-PTM:ien säätelyä. Tutkijat havaitsivat ORF8:n yhteyden kromatiiniin liittyviin proteiineihin, tuman laminaan ja histoneihin. Samoin kuin histonit, ORF8 käy läpi asetylaation histonijäljitelmämotiivin sisällä.

ORF8:n poistaminen johti viruksen replikaation vähentymiseen iAT2-soluissa, kun taas virusgenomin kopiomäärään vaikutti nimenomaisesti histonin jäljittelymotiivin menetys. Kaiken kaikkiaan tutkijat tunnistivat uuden histonimimikritapauksen SARS-CoV-2-infektion aikana ja kuvasivat mekanismeja, joilla virus häiritsee isäntäsolun kromatiinin säätelyä.

Viite:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z