Mimikrija histona pomoću proteina SARS-CoV-2 remeti epigenetsku regulaciju stanica domaćina

Mimikrija histona pomoću proteina SARS-CoV-2 remeti epigenetsku regulaciju stanica domaćina

U nedavnoj studiji objavljenoj u Priroda Istraživači su pokazali da protein teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirus 2 (SARS-CoV-2) djeluje kao mimik histona i remeti epigenetsku regulaciju stanica domaćina.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Trenutačni dokazi upućuju na to da infekcija SARS-CoV-2 potiskuje urođene imunološke odgovore i remeti epigenetsku regulaciju. Međutim, kako se to događa ostaje nepoznato. U rijetkim slučajevima, drugi virulentni virusi mogu interferirati s epigenetskom regulacijom oponašanjem proteina domaćina, osobito histona. Histoni pakiraju DNK u složene strukture i reguliraju pristup genomu.

Histoni su podložni spektru posttranslacijskih modifikacija (PTM) koje su dinamički regulirane kako bi kontrolirale ekspresiju gena. Histonska mimikrija omogućuje virusima da poremete sposobnost stanica da odgovore na infekciju i reguliraju ekspresiju gena. Unatoč tome, mimikrija histona pomoću koronavirusa (CoV) još nije potvrđena.

Studija i rezultati

Ova studija istraživala je koristi li SARS-CoV-2 mimikriju histona kako bi utjecao na regulaciju kromatina i odgovor na infekciju. Prvo su istraživači proveli bioinformatičku usporedbu proteina SARS-CoV-2 s ljudskim histonima. Postojalo je identično podudaranje šest ostataka između aminokiselina 50-55 otvorenog okvira čitanja 8 (ORF8) i kritičnih regija na N-terminusu histona H3.

Ovi ostaci leže u neuređenom području na površini monomernog ORF8. Zanimljivo, ARKS sekvenca je pronađena unutar ovog motiva, koji je prisutan na dva različita mjesta u H3 repu. Proteomska karakterizacija otkrila je da je DNA metiltransferaza 1 (DNMT1) partner za vezanje ORF8.

Zatim je ispitana intracelularna lokalizacija ORF8 kako bi se utvrdilo funkcionira li kao mimik histona. Stanice HEK293T transficirane su Strep-označenim konstruktom koji kodira ORF8, koji je vizualiziran korištenjem fluorescentne sonde. Imunofluorescencija je pokazala da je ORF8 tipično lokaliziran u citoplazmi i periferiji jezgre.

Međutim, frakcioniranje stanica pokazalo je da se nalazi i u jezgri i u citoplazmi. Osim toga, tim je otkrio da je ORF8 kolokaliziran s laminima B1 i A/C u transficiranim stanicama. Obrazac ekspresije potvrđen je u staničnoj liniji A549 zaraženoj SARS-CoV-2 koja eksprimira angiotenzin-konvertirajući enzim 2 (ACE2). Zatim je vezanje kromatina procijenjeno korištenjem rastućih koncentracija soli. ORF8 se odvojio od frakcije kromatina pri sličnim koncentracijama soli kao lamini i histoni.

Nasuprot tome, brisanje ARKSAP motiva u ORF8 (ORF8ΔARKSAP) omogućilo je disocijaciju pri nižim koncentracijama soli, sugerirajući da navodni histonski oponašajući motiv utječe na snagu povezanosti između ORF8 i kromatina. Imunoprecipitacija kromatina sa sekvenciranjem (ChIP-seq) pokazala je obogaćivanje ORF8 unutar specifičnih genomskih regija, posebno onih povezanih s modifikacijom H3K27me3.

Također je utvrđeno da se ORF8 povezuje s lizin acetiltransferazom 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP nije bio povezan s proteinima kromatina, što sugerira da motiv ARKSAP pojačava povezanost ORF8 s proteinima kromatina. Provedena je ciljana masena spektrometrijska analiza kako bi se istražilo je li mjesto oponašanja histona modificirano slično histonima. Ovo je identificiralo lizinski ostatak u predloženom mimičkom mjestu koje je acetilirano slično H3 histonu.

Nadalje, ekspresija ORF8 uzrokovala je značajno smanjenje obilja KAT2A, dok su proteini jezgrene lamine i razine heterokromatina povezane s laminom ostale nepromijenjene ili su blago porasle. Zatim je tim primijetio da su histonski PTM-ovi povezani s transkripcijskom represijom povećani u transficiranim HEK293T stanicama koje eksprimiraju ORF8, dok su oni povezani s ekspresijom aktivnog gena smanjeni. Konkretno, oni unutar ARKS motiva H3 bili su jako poremećeni.

Analiza kromatina dostupnog transpozazi korištenjem sekvenciranja visoke propusnosti pokazala je da ORF8 smanjuje dostupnost kromatina, ali ne i ORF8ΔARKSAP. Sekvencioniranje RNA provedeno je kako bi se definirali različito eksprimirani geni (DEG) u transficiranim stanicama. ORF8 i ORF8ΔARKSAP dijelili su podskup DEG-ova, ali prisutnost histonskog mimičkog motiva rezultirala je manje dinamičnim promjenama u ekspresiji gena.

Geni koji su bili smanjeno regulirani kao odgovor na ORF8 u usporedbi s ORF8ΔARKSAP imali su bolju dostupnost kromatina i više bazalne razine H3K9ac modifikacije nego pojačano regulirani geni. Zatim je stvoren mutirani SARS-CoV-2 bez ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Stanice A549ACE2 zaražene su ovim mutantom ili SARS-CoV-2 kako bi se usporedile razine virusnog genoma i proizvodnja virusnih čestica.

Nije bilo razlika u titrima virusa ili broju kopija genoma nakon 24 sata, a samo su manje promjene bile vidljive nakon 48 sati. Infekcija SARS-CoV-2 uzrokovala je snažan porast represivnih histonskih PTM-ova (H3K9me3 i H3K27me3). Nasuprot tome, ovaj učinak je oslabljen u odsutnosti ORF8.

Daljnji eksperimenti s mutiranim SARS-CoV-2 u kojem je motiv ARKSAP izbrisan iz ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) pokazali su značajno slabljenje učinaka infekcije na H3K9ac i dostupnost kromatina, replicirajući učinke brisanja ORF8. Infekcija divljim tipom SARS-CoV-2 smanjila je ekspresiju KAT2A, dok infekcija SARS-CoV-2ΔARKSAP ili SARS-CoV-2ΔORF8 nije.

Konačno, inducirane pluripotentne matične stanice (iPSC) izvedene iz alveolarnih stanica pluća tipa II (iAT2) zaražene su divljim tipom i mutiranim stanicama SARS-CoV-2. Broj kopija genoma mutantnih virusa smanjen je 48 sati nakon infekcije, što sugerira da ORF8, posebno ARKSAP motiv, utječe na replikaciju virusa. Virusne čestice koje je proizveo mutant ΔORF8 bile su manje od čestica virusa divljeg tipa. Nasuprot tome, čini se da je mutant ΔARKSAP sličan divljem tipu SARS-CoV-2, što sugerira da ORF8 ima funkciju stvaranja virusnih čestica neovisnu o ARKSAP-u.

Zaključci

Studija je pokazala da ORF8 SARS-CoV-2 sadrži ARKS motiv i da ekspresija ORF8 remeti regulaciju histonskih PTM-ova. Istraživači su otkrili povezanost ORF8 s proteinima povezanim s kromatinom, nuklearnom laminom i histonima. Slično histonima, ORF8 prolazi acetilaciju unutar histonskog oponašajućeg motiva.

Brisanje ORF8 rezultiralo je smanjenjem replikacije virusa u iAT2 stanicama, dok je na broj kopija virusnog genoma eksplicitno utjecao gubitak histonskog mimičkog motiva. Sve u svemu, istraživači su identificirali novi slučaj mimikrije histona tijekom infekcije SARS-CoV-2 i opisali mehanizme kojima virus remeti regulaciju kromatina u stanicama domaćina.

Referenca:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z