A SARS-CoV-2 fehérje hisztonutánzása megzavarja a gazdasejtek epigenetikai szabályozását

A SARS-CoV-2 fehérje hisztonutánzása megzavarja a gazdasejtek epigenetikai szabályozását

Egy nemrégiben megjelent tanulmányban Természet A kutatók kimutatták, hogy a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) fehérje hisztonutánzóként működik, és megzavarja a gazdasejtek epigenetikai szabályozását.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

A jelenlegi bizonyítékok arra utalnak, hogy a SARS-CoV-2 fertőzés elnyomja a veleszületett immunválaszokat és megzavarja az epigenetikai szabályozást. Az azonban, hogy ez hogyan történik, továbbra sem ismert. Ritka esetekben más virulens vírusok megzavarhatják az epigenetikai szabályozást azáltal, hogy utánozzák a gazdafehérjéket, különösen a hisztonokat. A hisztonok komplex struktúrákba csomagolják a DNS-t, és szabályozzák a genomhoz való hozzáférést.

A hisztonok a poszttranszlációs módosítások (PTM) spektrumának vannak kitéve, amelyek dinamikusan szabályozzák a génexpresszió szabályozását. A hiszton utánzás lehetővé teszi a vírusok számára, hogy megzavarják a sejtek fertőzésekre való reagáló képességét és szabályozzák a génexpressziót. Ennek ellenére a koronavírusok (CoV-k) hisztonutánzását még nem validálták.

A tanulmány és az eredmények

A jelen tanulmány azt vizsgálta, hogy a SARS-CoV-2 alkalmaz-e hisztonutánzatot a kromatin szabályozására és a fertőzésre adott válaszra. Először a kutatók elvégezték a SARS-CoV-2 fehérjék és az emberi hisztonok bioinformatikai összehasonlítását. A 8-as nyitott leolvasási keret (ORF8) 50-55. aminosavai és a H3 hiszton N-terminálisának kritikus régiói között azonos, hat maradékból álló egyezés volt.

Ezek a maradékok a monomer ORF8 felületének rendezetlen régiójában helyezkednek el. Érdekes módon az ARKS szekvenciát ebben a motívumban találták meg, amely a H3 farokban két különböző helyen található. A proteomikai jellemzés kimutatta, hogy a DNS-metiltranszferáz 1 (DNMT1) az ORF8 kötőpartnere.

Ezután megvizsgáltuk az ORF8 intracelluláris lokalizációját, hogy meghatározzuk, vajon hisztonutánzóként működik-e. A HEK293T sejteket ORF8-at kódoló Strep-címkézett konstrukcióval transzfektáltuk, amelyet fluoreszcens próbával tettünk láthatóvá. Az immunfluoreszcencia azt mutatta, hogy az ORF8 jellemzően a citoplazmában és a nukleáris periférián lokalizálódik.

A sejtfrakcionálás azonban azt mutatta, hogy mind a sejtmagban, mind a citoplazmában található. Ezenkívül a csapat azt találta, hogy az ORF8 a B1 és A/C laminákkal kolokalizálódott a transzfektált sejtekben. Az expressziós mintázatot a SARS-CoV-2-vel fertőzött, angiotenzin-konvertáló enzim 2-t (ACE2) expresszáló A549 sejtvonalban igazolták. Ezt követően a kromatin kötődését növekvő sókoncentráció alkalmazásával értékeltük. Az ORF8 hasonló sókoncentráció mellett disszociált a kromatin frakcióból, mint a laminák és a hisztonok.

Ezzel szemben az ARKSAP motívum törlése az ORF8-ban (ORF8ΔARKSAP) lehetővé tette a disszociációt alacsonyabb sókoncentrációknál, ami arra utal, hogy a feltételezett hisztonutánzó motívum befolyásolja az ORF8 és a kromatin közötti asszociáció erősségét. A szekvenálással végzett kromatin immunprecipitáció (ChIP-seq) kimutatta az ORF8 feldúsulását specifikus genomi régiókban, különösen azokon, amelyek a H3K27me3 módosításhoz kapcsolódnak.

Az ORF8-ról a lizin-acetil-transzferáz 2A-val (KAT2A) is társult. Az ORF8ΔARKSAP nem kapcsolódott kromatin fehérjékhez, ami arra utal, hogy az ARKSAP motívum fokozza az ORF8 asszociációját a kromatin fehérjékkel. Célzott tömegspektrometriás analízist végeztünk annak vizsgálatára, hogy a hisztonutánzó hely a hisztonokhoz hasonlóan módosul-e. Ez egy lizin maradékot azonosított a javasolt mimikai helyen, amely a H3 hisztonhoz hasonlóan acetileződött.

Ezenkívül az ORF8 expressziója szignifikánsan csökkentette a KAT2A mennyiségét, míg a nukleáris lamina fehérjék és a lamina-asszociált heterokromatin szintek változatlanok maradtak, vagy enyhén emelkedtek. Ezután a csapat megfigyelte, hogy a transzkripciós represszióhoz kapcsolódó hiszton PTM-ek megnövekedtek az ORF8-at expresszáló transzfektált HEK293T sejtekben, míg az aktív génexpresszióhoz kapcsolódóak kimerültek. Különösen a H3 ARKS-motívumán belüliek voltak erősen megzavarva.

A nagy áteresztőképességű szekvenálást alkalmazó transzpozázhoz hozzáférhető kromatin vizsgálat azt mutatta, hogy az ORF8 csökkentette a kromatin hozzáférhetőségét, de az ORF8AARKSAP nem. RNS-szekvenálást végeztünk a differenciálisan expresszált gének (DEG) meghatározására a transzfektált sejtekben. Az ORF8 és az ORF8ΔARKSAP a DEG-ek egy részhalmazát osztották meg, de a hisztonutánzó motívum jelenléte kevésbé dinamikus változásokat eredményezett a génexpresszióban.

Azok a gének, amelyek az ORF8-ra válaszul leszabályozottak az ORF8AARKSAP-hoz képest, jobb kromatin-hozzáférhetőséget és magasabb H3K9ac-módosítási szintet mutattak, mint a felszabályozott gének. Ezután egy mutáns SARS-CoV-2-t hoztunk létre, amelyből hiányzik az ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Az A549ACE2 sejteket ezzel a mutánssal vagy SARS-CoV-2-vel fertőztük meg, hogy összehasonlítsuk a vírusgenom szintjét és a vírusrészecske-termelést.

Nem volt különbség a vírustiterekben vagy a genom kópiaszámában 24 óra elteltével, és csak kisebb változások voltak nyilvánvalóak 48 órában. A SARS-CoV-2 fertőzés erős növekedést okozott a represszív hiszton PTM-ek (H3K9me3 és H3K27me3) számában. Ezzel szemben ez a hatás gyengült az ORF8 hiányában.

A mutáns SARS-CoV-2-vel végzett további kísérletek, amelyekben az ARKSAP-motívumot törölték az ORF8-ból (SARS-CoV-2AARKSAP), a fertőzés H3K9ac-re és a kromatin hozzáférhetőségére gyakorolt ​​hatásának jelentős gyengülését mutatták, megismételve az ORF8 deléció hatásait. A vad típusú SARS-CoV-2 fertőzés csökkentette a KAT2A expresszióját, míg a SARS-CoV-2ΔARKSAP vagy a SARS-CoV-2ΔORF8 fertőzés nem.

Végül indukált pluripotens őssejtből (iPSC) származó II-es típusú tüdőalveoláris sejteket (iAT2) fertőztünk meg vad típusú és mutáns SARS-CoV-2 sejtekkel. A mutáns vírusok genom kópiaszáma a fertőzés után 48 órával csökkent, ami arra utal, hogy az ORF8, különösen az ARKSAP motívum, befolyásolja a vírus replikációját. A ΔORF8 mutáns által termelt vírusrészecskék kevesebb volt, mint a vad típusú vírusé. Ezzel szemben a ΔARKSAP mutáns hasonlónak tűnt a vad típusú SARS-CoV-2-höz, ami arra utal, hogy az ORF8-nak ARKSAP-független funkciója van a vírusrészecske-generálásban.

Következtetések

A tanulmány kimutatta, hogy a SARS-CoV-2 ORF8-ja ARKS-motívumot tartalmaz, és az ORF8 expressziója megzavarja a hiszton PTM-ek szabályozását. A kutatók az ORF8 összefüggését találták kromatinhoz kapcsolódó fehérjékkel, nukleáris laminával és hisztonokkal. A hisztonokhoz hasonlóan az ORF8 is acetiláción megy keresztül a hisztonutánzó motívumban.

Az ORF8 törlése a vírus replikációjának csökkenését eredményezte az iAT2 sejtekben, míg a vírusgenom kópiaszámát kifejezetten befolyásolta a hisztonutánzó motívum elvesztése. Összességében a kutatók egy új hisztonmimikri esetet azonosítottak a SARS-CoV-2 fertőzés során, és leírták azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a vírus megzavarja a gazdasejt kromatin szabályozását.

Referencia:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z