Il mimetismo degli istoni da parte della proteina SARS-CoV-2 interrompe la regolazione epigenetica delle cellule ospiti

Il mimetismo degli istoni da parte della proteina SARS-CoV-2 interrompe la regolazione epigenetica delle cellule ospiti

In un recente studio pubblicato su Natura I ricercatori hanno dimostrato che una proteina del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave agisce come un imitatore dell’istone per interrompere la regolazione epigenetica delle cellule ospiti.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Le prove attuali suggeriscono che l’infezione da SARS-CoV-2 sopprime le risposte immunitarie innate e interrompe la regolazione epigenetica. Tuttavia, come ciò avvenga rimane sconosciuto. In rari casi, altri virus virulenti possono interferire con la regolazione epigenetica mimando le proteine ​​ospiti, in particolare gli istoni. Gli istoni confezionano il DNA in strutture complesse e regolano l'accesso al genoma.

Gli istoni sono soggetti a uno spettro di modifiche post-traduzionali (PTM) che sono regolate dinamicamente per controllare l'espressione genica. Il mimetismo istonico consente ai virus di interrompere la capacità delle cellule di rispondere alle infezioni e di regolare l’espressione genica. Tuttavia, il mimetismo degli istoni da parte dei coronavirus (CoV) non è stato ancora convalidato.

Lo studio e i risultati

Il presente studio ha esaminato se SARS-CoV-2 impiega la mimesi istonica per influenzare la regolazione della cromatina e la risposta alle infezioni. Innanzitutto, i ricercatori hanno condotto un confronto bioinformatico delle proteine ​​SARS-CoV-2 con gli istoni umani. C'era una corrispondenza identica di sei residui tra gli amminoacidi 50–55 del frame di lettura aperto 8 (ORF8) e le regioni critiche nell'N-terminale dell'istone H3.

Questi residui si trovano in una regione disordinata sulla superficie dell'ORF8 monomerico. È interessante notare che all'interno di questo motivo è stata trovata la sequenza ARKS, che è presente in due diverse posizioni nella coda H3. La caratterizzazione proteomica ha rivelato che la DNA metiltransferasi 1 (DNMT1) è il partner di legame di ORF8.

Successivamente, è stata esaminata la localizzazione intracellulare di ORF8 per determinare se funziona come un imitatore dell'istone. Le cellule HEK293T sono state trasfettate con un costrutto marcato con Strep che codifica ORF8, che è stato visualizzato utilizzando una sonda fluorescente. L'immunofluorescenza ha mostrato che ORF8 era tipicamente localizzato nel citoplasma e nella periferia nucleare.

Tuttavia, il frazionamento cellulare ha dimostrato che era localizzato sia nel nucleo che nel citoplasma. Inoltre, il team ha scoperto che ORF8 colocalizzava con le lamine B1 e A/C nelle cellule trasfettate. Il modello di espressione è stato confermato nella linea cellulare A549 infetta da SARS-CoV-2 che esprime l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2). Successivamente, il legame della cromatina è stato valutato utilizzando concentrazioni saline crescenti. ORF8 si è dissociato dalla frazione di cromatina a concentrazioni saline simili a quelle delle lamine e degli istoni.

Al contrario, l'eliminazione del motivo ARKSAP in ORF8 (ORF8ΔARKSAP) ha consentito la dissociazione a concentrazioni saline inferiori, suggerendo che il presunto motivo mimico dell'istone influenza la forza dell'associazione tra ORF8 e cromatina. L'immunoprecipitazione della cromatina con sequenziamento (ChIP-seq) ha dimostrato l'arricchimento di ORF8 all'interno di specifiche regioni genomiche, in particolare quelle associate alla modifica H3K27me3.

È stato scoperto anche che ORF8 si associa alla lisina acetiltransferasi 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP non era associato alle proteine ​​della cromatina, suggerendo che il motivo ARKSAP migliora l'associazione di ORF8 con le proteine ​​della cromatina. È stata eseguita un'analisi spettrometrica di massa mirata per indagare se il sito mimico dell'istone è modificato in modo simile agli istoni. Ciò ha identificato un residuo di lisina nel sito mimico proposto che è stato acetilato in modo simile all'istone H3.

Inoltre, l'espressione di ORF8 ha causato una diminuzione significativa dell'abbondanza di KAT2A, mentre le proteine ​​della lamina nucleare e i livelli di eterocromatina associati alla lamina sono rimasti invariati o sono aumentati leggermente. Successivamente, il team ha osservato che i PTM istonici associati alla repressione trascrizionale erano aumentati nelle cellule HEK293T trasfettate che esprimevano ORF8, mentre quelli associati all'espressione genica attiva erano esauriti. In particolare, quelli all'interno del motivo ARKS di H3 erano fortemente disturbati.

Il test della cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento ha mostrato che ORF8 ha ridotto l'accessibilità della cromatina, ma non ORF8ΔARKSAP. È stato eseguito il sequenziamento dell'RNA per definire i geni espressi in modo differenziale (DEG) nelle cellule trasfettate. ORF8 e ORF8ΔARKSAP condividevano un sottoinsieme di DEG, ma la presenza del motivo mimico dell'istone ha comportato cambiamenti meno dinamici nell'espressione genica.

I geni sottoregolati in risposta a ORF8 rispetto a ORF8ΔARKSAP avevano una migliore accessibilità alla cromatina e livelli basali più elevati di modifica H3K9ac rispetto ai geni sovraregolati. Successivamente, è stato generato un mutante SARS-CoV-2 privo di ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Le cellule A549ACE2 sono state infettate con questo mutante o SARS-CoV-2 per confrontare i livelli del genoma virale e la produzione di particelle virali.

Non sono state riscontrate differenze nei titoli dei virus o nel numero di copie del genoma dopo 24 ore e solo cambiamenti minori erano evidenti dopo 48 ore. L’infezione da SARS-CoV-2 ha causato un forte aumento dei PTM istonici repressivi (H3K9me3 e H3K27me3). Al contrario, questo effetto è stato attenuato in assenza di ORF8.

Ulteriori esperimenti con un SARS-CoV-2 mutante in cui il motivo ARKSAP è stato eliminato da ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) hanno mostrato un’attenuazione significativa degli effetti dell’infezione su H3K9ac e sull’accessibilità della cromatina, replicando gli effetti della delezione di ORF8. L’infezione con SARS-CoV-2 wild-type ha ridotto l’espressione di KAT2A, mentre l’infezione con SARS-CoV-2ΔARKSAP o SARS-CoV-2ΔORF8 no.

Infine, le cellule alveolari polmonari di tipo II derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) (iAT2) sono state infettate con cellule SARS-CoV-2 wild-type e mutanti. Il numero di copie del genoma dei virus mutanti è stato ridotto 48 ore dopo l'infezione, suggerendo che ORF8, in particolare il motivo ARKSAP, influenza la replicazione del virus. Le particelle virali prodotte dal mutante ΔORF8 erano inferiori a quelle del virus di tipo selvaggio. Al contrario, il mutante ΔARKSAP sembrava essere simile al SARS-CoV-2 di tipo selvaggio, suggerendo che ORF8 ha una funzione ARKSAP-indipendente di generazione di particelle virali.

Conclusioni

Lo studio ha dimostrato che l’ORF8 di SARS-CoV-2 contiene un motivo ARKS e che l’espressione di ORF8 interrompe la regolazione dei PTM istonici. I ricercatori hanno scoperto l'associazione di ORF8 con proteine ​​associate alla cromatina, lamina nucleare e istoni. Similmente agli istoni, ORF8 subisce acetilazione all'interno del motivo mimico dell'istone.

L'eliminazione di ORF8 ha comportato una riduzione della replicazione del virus nelle cellule iAT2, mentre il numero di copie del genoma virale è stato esplicitamente influenzato dalla perdita del motivo mimico dell'istone. Nel complesso, i ricercatori hanno identificato un nuovo caso di mimetismo istonico durante l’infezione da SARS-CoV-2 e hanno descritto i meccanismi mediante i quali il virus interrompe la regolazione della cromatina delle cellule ospiti.

Riferimento:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z