SARS-CoV-2 baltymo histono mimika sutrikdo epigenetinį šeimininkų ląstelių reguliavimą

SARS-CoV-2 baltymo histono mimika sutrikdo epigenetinį šeimininkų ląstelių reguliavimą

Neseniai paskelbtame tyrime Gamta Tyrėjai parodė, kad sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) baltymas veikia kaip histono imitatorius, sutrikdantis epigenetinį šeimininkų ląstelių reguliavimą.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Dabartiniai įrodymai rodo, kad infekcija SARS-CoV-2 slopina įgimtą imuninį atsaką ir sutrikdo epigenetinį reguliavimą. Tačiau kaip tai atsitiks, lieka nežinoma. Retais atvejais kiti virulentiški virusai gali trukdyti epigenetiniam reguliavimui, imituodami šeimininko baltymus, ypač histonus. Histonai pakuoja DNR į sudėtingas struktūras ir reguliuoja prieigą prie genomo.

Histonams taikomas daugybės posttransliacinių modifikacijų (PTM), kurios yra dinamiškai reguliuojamos genų ekspresijai kontroliuoti. Histonų mimika leidžia virusams sutrikdyti ląstelių gebėjimą reaguoti į infekciją ir reguliuoti genų ekspresiją. Nepaisant to, koronavirusų (CoV) histonų imitacija dar nepatvirtinta.

Tyrimas ir rezultatai

Šiame tyrime buvo tiriama, ar SARS-CoV-2 naudoja histono imitaciją, kad paveiktų chromatino reguliavimą ir atsaką į infekciją. Pirmiausia mokslininkai atliko SARS-CoV-2 baltymų bioinformatinį palyginimą su žmogaus histonais. Buvo identiškas šešių liekanų atitikimas tarp 50–55 atviro skaitymo rėmo (ORF8) aminorūgščių ir H3 histono N-gale esančių kritinių regionų.

Šios liekanos yra netvarkingoje monomerinio ORF8 paviršiaus srityje. Įdomu tai, kad šiame motyve buvo rasta ARKS seka, kuri yra dviejose skirtingose ​​H3 uodegos vietose. Proteominis apibūdinimas atskleidė, kad DNR metiltransferazė 1 (DNMT1) yra ORF8 surišimo partneris.

Tada buvo ištirta ORF8 tarpląstelinė lokalizacija, siekiant nustatyti, ar ji veikia kaip histono imitacija. HEK293T ląstelės buvo transfekuotos Strep pažymėta konstrukcija, koduojančia ORF8, kuri buvo vizualizuota naudojant fluorescencinį zondą. Imunofluorescencija parodė, kad ORF8 paprastai buvo lokalizuotas citoplazmoje ir branduolio periferijoje.

Tačiau ląstelių frakcionavimas parodė, kad jis buvo tiek branduolyje, tiek citoplazmoje. Be to, komanda nustatė, kad ORF8 kolokalizuotas su B1 ir A / C laminais transfekuotose ląstelėse. Ekspresijos modelis buvo patvirtintas SARS-CoV-2 užkrėstoje A549 ląstelių linijoje, ekspresuojančioje angiotenziną konvertuojantį fermentą 2 (ACE2). Tada buvo įvertintas chromatino surišimas naudojant didėjančią druskos koncentraciją. ORF8 atsiskyrė nuo chromatino frakcijos esant panašiai druskos koncentracijai kaip laminai ir histonai.

Priešingai, ARKSAP motyvo ištrynimas ORF8 (ORF8ΔARKSAP) leido disociuoti esant mažesnei druskos koncentracijai, o tai rodo, kad tariamas histono imitacijos motyvas turi įtakos ORF8 ir chromatino ryšio stiprumui. Chromatino imunoprecipitacija su sekos nustatymu (ChIP-seq) parodė ORF8 praturtėjimą specifiniuose genomo regionuose, ypač susijusiuose su H3K27me3 modifikacija.

Taip pat nustatyta, kad ORF8 yra susijęs su lizino acetiltransferaze 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP nebuvo susijęs su chromatino baltymais, o tai rodo, kad ARKSAP motyvas sustiprina ORF8 ryšį su chromatino baltymais. Buvo atlikta tikslinė masės spektrometrinė analizė, siekiant ištirti, ar histono imitacijos vieta yra modifikuota panašiai kaip histonai. Tai identifikavo lizino liekaną siūlomoje mimikos vietoje, kuri buvo acetilinta panašiai kaip H3 histonas.

Be to, ORF8 ekspresija žymiai sumažino KAT2A gausą, o branduolio laminato baltymų ir su laminatu susijusių heterochromatino lygiai nepakito arba šiek tiek padidėjo. Tada komanda pastebėjo, kad histono PTM, susiję su transkripcijos represijomis, padidėjo transfekuotose HEK293T ląstelėse, ekspresuojančiose ORF8, o tos, kurios susijusios su aktyvia genų ekspresija, buvo išeikvotos. Visų pirma, tie, kurie yra H3 ARKS motyve, buvo labai sutrikdyti.

Transpozazei prieinamas chromatino tyrimas, naudojant didelio našumo sekos nustatymą, parodė, kad ORF8 sumažino chromatino prieinamumą, bet ne ORF8ΔARKSAP. RNR seka buvo atlikta siekiant apibrėžti skirtingai išreikštus genus (DEG) transfekuotose ląstelėse. ORF8 ir ORF8ΔARKSAP dalijasi DEG pogrupiu, tačiau histono imitacijos motyvo buvimas lėmė mažiau dinamiškus genų ekspresijos pokyčius.

Genai, kurie buvo sumažinti reaguojant į ORF8, palyginti su ORF8ΔARKSAP, turėjo geresnį chromatino prieinamumą ir aukštesnius bazinius H3K9ac modifikacijos lygius nei aukštyn reguliuojami genai. Tada buvo sukurtas mutantas SARS-CoV-2, kuriam trūksta ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); A549ACE2 ląstelės buvo užkrėstos šiuo mutantu arba SARS-CoV-2, kad būtų galima palyginti viruso genomo lygius ir viruso dalelių gamybą.

Per 24 valandas viruso titrai ar genomo kopijų skaičius nesiskyrė, o po 48 valandų buvo matomi tik nedideli pokyčiai. SARS-CoV-2 infekcija sukėlė stiprų represinių histonų PTM (H3K9me3 ir H3K27me3) padidėjimą. Ir atvirkščiai, šis poveikis susilpnėjo, jei nebuvo ORF8.

Kiti eksperimentai su mutantu SARS-CoV-2, kuriame ARKSAP motyvas buvo ištrintas iš ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP), parodė reikšmingą infekcijos poveikio H3K9ac ir chromatino prieinamumui susilpnėjimą, atkartojant ORF8 delecijos poveikį. Infekcija laukinio tipo SARS-CoV-2 sumažino KAT2A ekspresiją, o SARS-CoV-2ΔARKSAP arba SARS-CoV-2ΔORF8 infekcija nesumažino.

Galiausiai, iš indukuotų pluripotentinių kamieninių ląstelių (iPSC) gautos II tipo plaučių alveolinės ląstelės (iAT2) buvo užkrėstos laukinio tipo ir mutantinėmis SARS-CoV-2 ląstelėmis. Mutantinių virusų genomo kopijų skaičius sumažėjo praėjus 48 valandoms po užsikrėtimo, o tai rodo, kad ORF8, ypač ARKSAP motyvas, veikia viruso replikaciją. Viruso dalelių, kurias gamina ΔORF8 mutantas, buvo mažiau nei laukinio tipo viruso. Priešingai, ΔARKSAP mutantas atrodė panašus į laukinio tipo SARS-CoV-2, o tai rodo, kad ORF8 turi nuo ARKSAP nepriklausomą virusinių dalelių generavimo funkciją.

Išvados

Tyrimas parodė, kad SARS-CoV-2 ORF8 turi ARKS motyvą ir kad ORF8 ekspresija sutrikdo histono PTM reguliavimą. Tyrėjai nustatė ORF8 ryšį su chromatinu susijusiais baltymais, branduolio sluoksniu ir histonais. Panašiai kaip ir histonai, ORF8 acetilinamas histono imitacijos motyve.

Ištrynus ORF8, sumažėjo viruso replikacija iAT2 ląstelėse, o viruso genomo kopijų skaičių aiškiai paveikė histono imitacijos motyvo praradimas. Apskritai mokslininkai nustatė naują histono mimikos atvejį SARS-CoV-2 infekcijos metu ir aprašė mechanizmus, kuriais virusas sutrikdo šeimininko ląstelių chromatino reguliavimą.

Nuoroda:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z