SARS-CoV-2 proteīna histona imitācija izjauc saimniekšūnu epiģenētisko regulējumu

SARS-CoV-2 proteīna histona imitācija izjauc saimniekšūnu epiģenētisko regulējumu

Nesenā pētījumā, kas publicēts Daba Pētnieki parādīja, ka smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2) proteīns darbojas kā histona imitators, lai izjauktu saimniekšūnu epiģenētisko regulējumu.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Pašreizējie pierādījumi liecina, ka infekcija ar SARS-CoV-2 nomāc iedzimtas imūnās atbildes un izjauc epiģenētisko regulējumu. Tomēr, kā tas notiek, joprojām nav zināms. Retos gadījumos citi virulenti vīrusi var traucēt epiģenētisko regulējumu, atdarinot saimniekproteīnus, īpaši histonus. Histoni iesaiņo DNS sarežģītās struktūrās un regulē piekļuvi genomam.

Histoni ir pakļauti virknei pēctranslācijas modifikāciju (PTM), kas tiek dinamiski regulētas, lai kontrolētu gēnu ekspresiju. Histonu mīmika ļauj vīrusiem izjaukt šūnu spēju reaģēt uz infekciju un regulēt gēnu ekspresiju. Tomēr koronavīrusu (CoV) histona atdarināšana vēl nav apstiprināta.

Pētījums un rezultāti

Šajā pētījumā tika pētīts, vai SARS-CoV-2 izmanto histona imitāciju, lai ietekmētu hromatīna regulēšanu un infekcijas reakciju. Pirmkārt, pētnieki veica SARS-CoV-2 proteīnu bioinformātikas salīdzinājumu ar cilvēka histoniem. Bija identiska sešu atlieku atbilstība starp atvērtā nolasīšanas rāmja 8 (ORF8) 50.–55. aminoskābēm un H3 histona N-gala kritiskajiem reģioniem.

Šie atlikumi atrodas nesakārtotā reģionā uz monomēra ORF8 virsmas. Interesanti, ka šajā motīvā tika atrasta ARKS secība, kas atrodas divās dažādās H3 astes vietās. Proteomiskais raksturojums atklāja, ka DNS metiltransferāze 1 (DNMT1) ir ORF8 saistīšanās partneris.

Pēc tam tika pārbaudīta ORF8 intracelulārā lokalizācija, lai noteiktu, vai tā darbojas kā histona imitācija. HEK293T šūnas tika transficētas ar Strep marķētu konstrukciju, kas kodē ORF8, kas tika vizualizēta, izmantojot fluorescējošu zondi. Imunofluorescence parādīja, ka ORF8 parasti tika lokalizēts citoplazmā un kodola perifērijā.

Tomēr šūnu frakcionēšana parādīja, ka tā atrodas gan kodolā, gan citoplazmā. Turklāt komanda atklāja, ka ORF8 kolokalizējās ar lamīniem B1 un A / C transfektētajās šūnās. Ekspresijas modelis tika apstiprināts ar SARS-CoV-2 inficētajā A549 šūnu līnijā, kas ekspresē angiotenzīnu konvertējošo enzīmu 2 (ACE2). Pēc tam tika novērtēta hromatīna saistīšanās, izmantojot pieaugošas sāls koncentrācijas. ORF8 atdalījās no hromatīna frakcijas līdzīgās sāls koncentrācijās kā lamīni un histoni.

Turpretim ARKSAP motīva dzēšana ORF8 (ORF8ΔARKSAP) ļāva disociēties pie zemākām sāls koncentrācijām, kas liecina, ka iespējamais histona imitācijas motīvs ietekmē ORF8 un hromatīna saistību. Hromatīna imunoprecipitācija ar sekvencēšanu (ChIP-seq) parādīja ORF8 bagātināšanu konkrētos genoma reģionos, īpaši tajos, kas saistīti ar H3K27me3 modifikāciju.

Tika konstatēts arī, ka ORF8 saistās ar lizīna acetiltransferāzi 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP nebija saistīts ar hromatīna proteīniem, kas liecina, ka ARKSAP motīvs uzlabo ORF8 saistību ar hromatīna proteīniem. Tika veikta mērķtiecīga masas spektrometriskā analīze, lai noskaidrotu, vai histona imitācijas vieta ir modificēta līdzīgi kā histoniem. Tas identificēja lizīna atlikumu ierosinātajā mīmikas vietā, kas tika acetilēts līdzīgi kā H3 histons.

Turklāt ORF8 ekspresija izraisīja ievērojamu KAT2A pārpilnības samazināšanos, savukārt kodola lamina proteīnu un ar laminātu saistītā heterohromatīna līmenis nemainījās vai nedaudz palielinājās. Pēc tam komanda novēroja, ka histona PTM, kas saistīti ar transkripcijas represijām, tika palielināti transficētajās HEK293T šūnās, kas ekspresē ORF8, bet tās, kas saistītas ar aktīvo gēnu ekspresiju, tika izsmeltas. Jo īpaši tie, kas atrodas H3 ARKS motīvā, bija ļoti traucēti.

Transpozāzei pieejamais hromatīna tests, izmantojot augstas caurlaidības sekvencēšanu, parādīja, ka ORF8 samazināja hromatīna pieejamību, bet ne ORF8ΔARKSAP. RNS sekvencēšana tika veikta, lai definētu diferencēti ekspresētus gēnus (DEG) transfektētajās šūnās. ORF8 un ORF8ΔARKSAP koplietoja DEG apakškopu, bet histona imitācijas motīva klātbūtne izraisīja mazāk dinamiskas izmaiņas gēnu ekspresijā.

Gēniem, kas tika samazināti, reaģējot uz ORF8, salīdzinot ar ORF8ΔARKSAP, bija labāka hromatīna pieejamība un augstāks H3K9ac modifikācijas bāzes līmenis nekā augšregulētiem gēniem. Pēc tam tika izveidots mutants SARS-CoV-2, kam trūkst ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); A549ACE2 šūnas tika inficētas ar šo mutantu vai SARS-CoV-2, lai salīdzinātu vīrusa genoma līmeni un vīrusa daļiņu veidošanos.

24 stundās nebija atšķirību vīrusu titros vai genoma kopiju skaitā, un 48 stundās bija redzamas tikai nelielas izmaiņas. SARS-CoV-2 infekcija izraisīja spēcīgu represīvo histonu PTM (H3K9me3 un H3K27me3) pieaugumu. Un otrādi, šis efekts tika vājināts, ja nebija ORF8.

Turpmākie eksperimenti ar mutantu SARS-CoV-2, kurā ARKSAP motīvs tika izdzēsts no ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP), parādīja būtisku infekcijas ietekmes pavājināšanos uz H3K9ac un hromatīna pieejamību, atkārtojot ORF8 dzēšanas ietekmi. Inficēšanās ar savvaļas tipa SARS-CoV-2 samazināja KAT2A ekspresiju, savukārt SARS-CoV-2ΔARKSAP vai SARS-CoV-2ΔORF8 infekcija to nedarīja.

Visbeidzot, inducētās pluripotentās cilmes šūnas (iPSC) iegūtās II tipa plaušu alveolārās šūnas (iAT2) tika inficētas ar savvaļas tipa un mutantām SARS-CoV-2 šūnām. Mutantu vīrusu genoma kopiju skaits tika samazināts 48 stundas pēc inficēšanās, kas liecina, ka ORF8, īpaši ARKSAP motīvs, ietekmē vīrusa replikāciju. Vīrusa daļiņas, ko ražoja ΔORF8 mutants, bija mazāk nekā savvaļas tipa vīrusa daļiņas. Turpretim ΔARKSAP mutants šķita līdzīgs savvaļas tipa SARS-CoV-2, kas liecina, ka ORF8 ir no ARKSAP neatkarīga vīrusa daļiņu ģenerēšanas funkcija.

Secinājumi

Pētījums parādīja, ka SARS-CoV-2 ORF8 satur ARKS motīvu un ka ORF8 ekspresija traucē histona PTM regulēšanu. Pētnieki atklāja ORF8 saistību ar ar hromatīnu saistītajiem proteīniem, kodola laminātu un histoniem. Līdzīgi kā histoniem, ORF8 tiek acetilēts histona imitācijas motīvā.

ORF8 dzēšana izraisīja vīrusa replikācijas samazināšanos iAT2 šūnās, savukārt vīrusa genoma kopiju skaitu nepārprotami ietekmēja histona imitācijas motīva zudums. Kopumā pētnieki identificēja jaunu histonu mīmikas gadījumu SARS-CoV-2 infekcijas laikā un aprakstīja mehānismus, ar kuriem vīruss izjauc saimniekšūnu hromatīna regulēšanu.

Atsauce:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z