Histon-etterligning av SARS-CoV-2-proteinet forstyrrer den epigenetiske reguleringen av vertsceller

Histon-etterligning av SARS-CoV-2-proteinet forstyrrer den epigenetiske reguleringen av vertsceller

I en fersk studie publisert i Natur Forskere viste at et alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)-protein fungerer som en histonetterligning for å forstyrre epigenetisk regulering av vertsceller.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Nåværende bevis tyder på at infeksjon med SARS-CoV-2 undertrykker medfødt immunrespons og forstyrrer epigenetisk regulering. Hvordan dette skjer er imidlertid ukjent. I sjeldne tilfeller kan andre virulente virus forstyrre epigenetisk regulering ved å etterligne vertsproteiner, spesielt histoner. Histoner pakker DNA inn i komplekse strukturer og regulerer tilgangen til genomet.

Histoner er gjenstand for et spekter av post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) som er dynamisk regulert for å kontrollere genuttrykk. Histonmimikk lar virus forstyrre cellenes evne til å reagere på infeksjon og regulere genuttrykk. Ikke desto mindre er histonmimicry av koronavirus (CoVs) ennå ikke validert.

Studien og resultatene

Denne studien undersøkte om SARS-CoV-2 bruker histonmimik for å påvirke kromatinregulering og infeksjonsrespons. Først gjennomførte forskerne en bioinformatikk-sammenligning av SARS-CoV-2-proteiner med humane histoner. Det var en identisk seks-rester-match mellom aminosyrene 50–55 i åpen leseramme 8 (ORF8) og de kritiske områdene i N-terminalen av H3-histonet.

Disse restene ligger i et uordnet område på overflaten av den monomere ORF8. Interessant nok ble ARKS-sekvensen funnet i dette motivet, som er til stede på to forskjellige steder i H3-halen. Proteomisk karakterisering avslørte at DNA-metyltransferase 1 (DNMT1) er bindingspartneren til ORF8.

Deretter ble den intracellulære lokaliseringen av ORF8 undersøkt for å bestemme om den fungerer som en histonetterligning. HEK293T-celler ble transfektert med en Strep-merket konstruksjon som koder for ORF8, som ble visualisert ved bruk av en fluorescerende probe. Immunfluorescens viste at ORF8 typisk var lokalisert i cytoplasma og kjernefysisk periferi.

Imidlertid viste cellefraksjonering at den var lokalisert i både kjernen og cytoplasmaet. I tillegg fant teamet at ORF8 kolokaliserte seg med laminer B1 og A/C i transfekterte celler. Ekspresjonsmønsteret ble bekreftet i den SARS-CoV-2-infiserte A549-cellelinjen som uttrykker angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2). Deretter ble kromatinbinding vurdert ved bruk av økende saltkonsentrasjoner. ORF8 dissosierte fra kromatinfraksjonen ved lignende saltkonsentrasjoner som laminer og histoner.

I motsetning til dette muliggjorde sletting av ARKSAP-motivet i ORF8 (ORF8ΔARKSAP) dissosiasjon ved lavere saltkonsentrasjoner, noe som antyder at det antatte histon-mimiske motivet påvirker styrken til assosiasjonen mellom ORF8 og kromatin. Kromatin-immunutfelling med sekvensering (ChIP-seq) demonstrerte berikelsen av ORF8 innenfor spesifikke genomiske regioner, spesielt de assosiert med H3K27me3-modifikasjonen.

ORF8 ble også funnet å assosiere med lysinacetyltransferase 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP var ikke assosiert med kromatinproteiner, noe som tyder på at ARKSAP-motivet forbedrer assosiasjonen av ORF8 med kromatinproteiner. En målrettet massespektrometrisk analyse ble utført for å undersøke om det histone-mimiske stedet er modifisert på samme måte som histoner. Dette identifiserte en lysinrest i det foreslåtte etterligningsstedet som ble acetylert på samme måte som H3-histon.

Videre forårsaket ORF8-ekspresjon en signifikant reduksjon i KAT2A-overflod, mens nukleære lamina-proteiner og lamina-assosierte heterokromatinnivåer forble uendret eller økte litt. Deretter observerte teamet at histon-PTM-er assosiert med transkripsjonell undertrykkelse ble økt i transfekterte HEK293T-celler som uttrykker ORF8, mens de assosiert med aktivt genuttrykk var utarmet. Spesielt var de innenfor ARKS-motivet til H3 sterkt forstyrret.

Den transposase-tilgjengelige kromatinanalysen ved bruk av high-throughput-sekvensering viste at ORF8 reduserte kromatintilgjengeligheten, men ikke ORF8ΔARKSAP. RNA-sekvensering ble utført for å definere differensielt uttrykte gener (DEG) i transfekterte celler. ORF8 og ORF8ΔARKSAP delte en undergruppe av DEG-er, men tilstedeværelsen av det histon-mimiske motivet resulterte i mindre dynamiske endringer i genuttrykk.

Gener som ble nedregulert som respons på ORF8 sammenlignet med ORF8ΔARKSAP hadde bedre kromatintilgjengelighet og høyere basale nivåer av H3K9ac-modifikasjon enn oppregulerte gener. Deretter ble en mutant SARS-CoV-2 som mangler ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8) generert; A549ACE2-celler ble infisert med denne mutanten eller SARS-CoV-2 for å sammenligne virale genomnivåer og viral partikkelproduksjon.

Det var ingen forskjeller i virustitere eller genomkopiantall etter 24 timer, og bare mindre endringer var tydelige etter 48 timer. SARS-CoV-2-infeksjon forårsaket en sterk økning i repressive histon-PTM-er (H3K9me3 og H3K27me3). Motsatt ble denne effekten dempet i fravær av ORF8.

Ytterligere eksperimenter med en mutant SARS-CoV-2 der ARKSAP-motivet ble slettet fra ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) viste en betydelig dempning av effektene av infeksjon på H3K9ac og kromatintilgjengelighet, og replikerte effekten av ORF8-sletting. Infeksjon med villtype SARS-CoV-2 reduserte KAT2A-ekspresjon, mens SARS-CoV-2ΔARKSAP eller SARS-CoV-2ΔORF8-infeksjon ikke gjorde det.

Til slutt ble induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede type II lungealveolære celler (iAT2) infisert med villtype og mutante SARS-CoV-2-celler. Genomkopieringstallet til mutante virus ble redusert 48 timer etter infeksjon, noe som tyder på at ORF8, spesielt ARKSAP-motivet, påvirker virusreplikasjonen. Viruspartiklene produsert av ΔORF8-mutanten var færre enn de av villtypeviruset. Derimot så ΔARKSAP-mutanten ut til å være lik villtype SARS-CoV-2, noe som tyder på at ORF8 har en ARKSAP-uavhengig funksjon for generering av viral partikkel.

Konklusjoner

Studien viste at ORF8 av SARS-CoV-2 inneholder et ARKS-motiv og at uttrykk for ORF8 forstyrrer reguleringen av histon PTM. Forskerne fant assosiasjonen til ORF8 med kromatinassosierte proteiner, kjernefysisk lamina og histoner. I likhet med histoner gjennomgår ORF8 acetylering innenfor histon-mimisk motiv.

Sletting av ORF8 resulterte i en reduksjon i virusreplikasjon i iAT2-celler, mens det virale genomets kopinummer ble eksplisitt påvirket av tap av histon-mimisk motiv. Totalt sett identifiserte forskerne et nytt tilfelle av histon-mimicry under SARS-CoV-2-infeksjon og beskrev mekanismer som viruset forstyrrer vertscellekromatinreguleringen.

Referanse:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z