Mimikra histonów przez białko SARS-CoV-2 zakłóca epigenetyczną regulację komórek gospodarza

Mimikra histonów przez białko SARS-CoV-2 zakłóca epigenetyczną regulację komórek gospodarza

W niedawnym badaniu opublikowanym w Natura Naukowcy wykazali, że białko wirusa 2 wirusa ciężkiego ostrego układu oddechowego (SARS-CoV-2) działa jak naśladowca histonów, zakłócając epigenetyczną regulację komórek gospodarza.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Aktualne dowody sugerują, że zakażenie SARS-CoV-2 tłumi wrodzoną odpowiedź immunologiczną i zakłóca regulację epigenetyczną. Jednak jak to się dzieje, pozostaje nieznane. W rzadkich przypadkach inne zjadliwe wirusy mogą zakłócać regulację epigenetyczną, naśladując białka gospodarza, zwłaszcza histony. Histony pakują DNA w złożone struktury i regulują dostęp do genomu.

Histony podlegają spektrum modyfikacji potranslacyjnych (PTM), które są dynamicznie regulowane w celu kontrolowania ekspresji genów. Mimikra histonów umożliwia wirusom zakłócanie zdolności komórek do reagowania na infekcję i regulowanie ekspresji genów. Niemniej jednak mimikra histonów przez koronawirusy (CoV) nie została jeszcze potwierdzona.

Badanie i wyniki

W niniejszym badaniu sprawdzano, czy SARS-CoV-2 wykorzystuje mimikrę histonów do wpływania na regulację chromatyny i odpowiedź na infekcję. Najpierw naukowcy przeprowadzili bioinformatyczne porównanie białek SARS-CoV-2 z ludzkimi histonami. Wystąpiło identyczne dopasowanie sześciu reszt pomiędzy aminokwasami 50–55 otwartej ramki odczytu 8 (ORF8) i regionami krytycznymi na końcu N histonu H3.

Reszty te leżą w nieuporządkowanym obszarze na powierzchni monomerycznej ORF8. Co ciekawe, w tym motywie znaleziono sekwencję ARKS, która występuje w dwóch różnych miejscach ogona H3. Charakterystyka proteomiczna ujawniła, że ​​metylotransferaza DNA 1 (DNMT1) jest partnerem wiążącym ORF8.

Następnie zbadano wewnątrzkomórkową lokalizację ORF8, aby określić, czy działa ona jako naśladowca histonów. Komórki HEK293T transfekowano konstruktem ze znacznikiem Strep kodującym ORF8, który wizualizowano za pomocą sondy fluorescencyjnej. Immunofluorescencja wykazała, że ​​ORF8 była zazwyczaj zlokalizowana w cytoplazmie i na obrzeżach jądra.

Jednakże frakcjonowanie komórek wykazało, że znajdował się on zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Ponadto zespół odkrył, że ORF8 kolokalizował z laminami B1 i A/C w transfekowanych komórkach. Wzorzec ekspresji potwierdzono w linii komórkowej A549 zakażonej SARS-CoV-2, wykazującej ekspresję enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2). Następnie oceniano wiązanie chromatyny, stosując rosnące stężenia soli. ORF8 oddzieliła się od frakcji chromatyny przy podobnych stężeniach soli jak laminy i histony.

Natomiast delecja motywu ARKSAP w ORF8 (ORF8ΔARKSAP) umożliwiła dysocjację przy niższych stężeniach soli, co sugeruje, że przypuszczalny motyw naśladujący histony wpływa na siłę asocjacji między ORF8 i chromatyną. Immunoprecypitacja chromatyny z sekwencjonowaniem (ChIP-seq) wykazała wzbogacenie ORF8 w obrębie określonych regionów genomu, szczególnie tych związanych z modyfikacją H3K27me3.

Stwierdzono także, że ORF8 wiąże się z acetylotransferazą lizyny 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP nie był powiązany z białkami chromatyny, co sugeruje, że motyw ARKSAP wzmacnia powiązanie ORF8 z białkami chromatyny. Przeprowadzono ukierunkowaną analizę spektrometrii masowej w celu zbadania, czy miejsce naśladujące histony jest modyfikowane podobnie do histonów. Zidentyfikowało to resztę lizyny w proponowanym miejscu mimicznym, która była acetylowana podobnie do histonu H3.

Co więcej, ekspresja ORF8 spowodowała znaczny spadek obfitości KAT2A, podczas gdy poziomy białek blaszki jądrowej i heterochromatyny związanej z blaszką pozostały niezmienione lub nieznacznie wzrosły. Następnie zespół zaobserwował, że w transfekowanych komórkach HEK293T wykazujących ekspresję ORF8 zwiększono liczbę PTM histonów związanych z represją transkrypcji, podczas gdy te związane z aktywną ekspresją genów uległy zmniejszeniu. W szczególności te w motywie ARKS H3 zostały silnie zakłócone.

Test chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu sekwencjonowania o dużej przepustowości wykazał, że ORF8 zmniejsza dostępność chromatyny, ale nie ORF8ΔARKSAP. Przeprowadzono sekwencjonowanie RNA w celu zdefiniowania genów ulegających zróżnicowanej ekspresji (DEG) w transfekowanych komórkach. ORF8 i ORF8ΔARKSAP mają wspólny podzbiór DEG, ale obecność motywu naśladującego histony skutkowała mniej dynamicznymi zmianami w ekspresji genów.

Geny, które uległy obniżeniu w odpowiedzi na ORF8 w porównaniu z ORF8ΔARKSAP, charakteryzowały się lepszą dostępnością chromatyny i wyższymi podstawowymi poziomami modyfikacji H3K9ac niż geny o zwiększonej ekspresji. Następnie wygenerowano zmutowanego SARS-CoV-2 pozbawionego ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Komórki A549ACE2 zakażono tym mutantem lub SARS-CoV-2, aby porównać poziomy genomu wirusa i produkcję cząstek wirusa.

Nie stwierdzono różnic w mianach wirusa ani liczbie kopii genomu po 24 godzinach, a po 48 godzinach widoczne były jedynie niewielkie zmiany. Zakażenie SARS-CoV-2 spowodowało silny wzrost represyjnych histonów PTM (H3K9me3 i H3K27me3). I odwrotnie, efekt ten był osłabiony przy braku ORF8.

Dalsze eksperymenty ze zmutowanym SARS-CoV-2, w którym usunięto motyw ARKSAP z ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) wykazały znaczne osłabienie wpływu infekcji na H3K9ac i dostępność chromatyny, replikując skutki delecji ORF8. Zakażenie SARS-CoV-2 typu dzikiego zmniejszyło ekspresję KAT2A, podczas gdy zakażenie SARS-CoV-2ΔARKSAP lub SARS-CoV-2ΔORF8 nie.

Na koniec, pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) komórki pęcherzykowe płuc typu II (iAT2) zakażono komórkami SARS-CoV-2 typu dzikiego i zmutowanymi. Liczba kopii genomu zmutowanych wirusów zmniejszyła się 48 godzin po zakażeniu, co sugeruje, że ORF8, zwłaszcza motyw ARKSAP, wpływa na replikację wirusa. Cząstek wirusa wytwarzanych przez mutanta ΔORF8 było mniej niż w przypadku wirusa typu dzikiego. Natomiast mutant ΔARKSAP okazał się podobny do SARS-CoV-2 typu dzikiego, co sugeruje, że ORF8 ma niezależną od ARKSAP funkcję wytwarzania cząstek wirusowych.

Wnioski

Badanie wykazało, że ORF8 SARS-CoV-2 zawiera motyw ARKS i że ekspresja ORF8 zakłóca regulację histonów PTM. Naukowcy odkryli powiązanie ORF8 z białkami związanymi z chromatyną, blaszką jądrową i histonami. Podobnie jak histony, ORF8 ulega acetylacji w obrębie motywu naśladującego histony.

Delecja ORF8 spowodowała zmniejszenie replikacji wirusa w komórkach iAT2, podczas gdy na liczbę kopii genomu wirusa wyraźnie wpływała utrata motywu naśladującego histony. Ogólnie rzecz biorąc, badacze zidentyfikowali nowy przypadek mimikry histonów podczas zakażenia SARS-CoV-2 i opisali mechanizmy, dzięki którym wirus zakłóca regulację chromatyny w komórkach gospodarza.

Odniesienie:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z