O mimetismo de histonas pela proteína SARS-CoV-2 perturba a regulação epigenética das células hospedeiras

O mimetismo de histonas pela proteína SARS-CoV-2 perturba a regulação epigenética das células hospedeiras

Num estudo recente publicado em Natureza Os pesquisadores mostraram que uma proteína do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) atua como um imitador de histonas para interromper a regulação epigenética das células hospedeiras.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

As evidências atuais sugerem que a infecção pelo SARS-CoV-2 suprime as respostas imunes inatas e perturba a regulação epigenética. No entanto, como isso acontece permanece desconhecido. Em casos raros, outros vírus virulentos podem interferir na regulação epigenética, imitando proteínas do hospedeiro, particularmente histonas. As histonas empacotam o DNA em estruturas complexas e regulam o acesso ao genoma.

As histonas estão sujeitas a um espectro de modificações pós-traducionais (PTMs) que são reguladas dinamicamente para controlar a expressão genética. O mimetismo de histonas permite que os vírus interrompam a capacidade das células de responder à infecção e regular a expressão genética. No entanto, o mimetismo de histonas por coronavírus (CoVs) ainda não foi validado.

O estudo e resultados

O presente estudo investigou se o SARS-CoV-2 emprega mimetismo de histonas para afetar a regulação da cromatina e a resposta à infecção. Primeiro, os pesquisadores conduziram uma comparação bioinformática das proteínas SARS-CoV-2 com histonas humanas. Houve uma correspondência idêntica de seis resíduos entre os aminoácidos 50-55 do quadro de leitura aberto 8 (ORF8) e as regiões críticas no terminal N da histona H3.

Estes resíduos encontram-se numa região desordenada na superfície da ORF8 monomérica. Curiosamente, a sequência ARKS foi encontrada dentro deste motivo, que está presente em dois locais diferentes na cauda H3. A caracterização proteômica revelou que a DNA metiltransferase 1 (DNMT1) é o parceiro de ligação da ORF8.

Em seguida, a localização intracelular da ORF8 foi examinada para determinar se ela funciona como um mimetizador de histonas. As células HEK293T foram transfectadas com uma construção marcada com Strep que codifica ORF8, que foi visualizada utilizando uma sonda fluorescente. A imunofluorescência mostrou que a ORF8 estava tipicamente localizada no citoplasma e na periferia nuclear.

No entanto, o fracionamento celular mostrou que ela estava localizada tanto no núcleo quanto no citoplasma. Além disso, a equipe descobriu que a ORF8 co-localizava com as laminas B1 e A/C em células transfectadas. O padrão de expressão foi confirmado na linhagem celular A549 infectada por SARS-CoV-2 que expressa a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2). Em seguida, a ligação à cromatina foi avaliada utilizando concentrações crescentes de sal. ORF8 dissociou-se da fração da cromatina em concentrações de sal semelhantes às laminas e histonas.

Em contraste, a deleção do motivo ARKSAP em ORF8 (ORF8ΔARKSAP) permitiu a dissociação em concentrações salinas mais baixas, sugerindo que o suposto motivo imitador de histonas influencia a força de associação entre ORF8 e cromatina. A imunoprecipitação da cromatina com sequenciamento (ChIP-seq) demonstrou o enriquecimento de ORF8 em regiões genômicas específicas, particularmente aquelas associadas à modificação H3K27me3.

Verificou-se também que ORF8 se associa à lisina acetiltransferase 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP não foi associado a proteínas da cromatina, sugerindo que o motivo ARKSAP aumenta a associação de ORF8 com proteínas da cromatina. Uma análise espectrométrica de massa direcionada foi realizada para investigar se o sítio mimetizador de histonas é modificado de forma semelhante às histonas. Isto identificou um resíduo de lisina no sítio mimético proposto que foi acetilado de forma semelhante à histona H3.

Além disso, a expressão de ORF8 causou uma diminuição significativa na abundância de KAT2A, enquanto as proteínas da lâmina nuclear e os níveis de heterocromatina associados à lâmina permaneceram inalterados ou aumentaram ligeiramente. Em seguida, a equipe observou que os PTMs de histonas associados à repressão transcricional estavam aumentados em células HEK293T transfectadas que expressam ORF8, enquanto aqueles associados à expressão gênica ativa estavam esgotados. Em particular, aqueles dentro do motivo ARKS de H3 foram altamente interrompidos.

O ensaio de cromatina acessível por transposase usando sequenciamento de alto rendimento mostrou que o ORF8 diminuiu a acessibilidade da cromatina, mas não o ORF8ΔARKSAP. O sequenciamento de RNA foi realizado para definir genes diferencialmente expressos (DEGs) em células transfectadas. ORF8 e ORF8ΔARKSAP compartilharam um subconjunto de DEGs, mas a presença do motivo mimetizador de histonas resultou em alterações menos dinâmicas na expressão gênica.

Os genes que foram regulados negativamente em resposta ao ORF8 em comparação com o ORF8ΔARKSAP apresentaram melhor acessibilidade à cromatina e níveis basais mais elevados de modificação do H3K9ac do que os genes regulados positivamente. Em seguida, foi gerado um SARS-CoV-2 mutante sem ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); As células A549ACE2 foram infectadas com este mutante ou SARS-CoV-2 para comparar os níveis do genoma viral e a produção de partículas virais.

Não houve diferenças nos títulos de vírus ou no número de cópias do genoma às 24 horas, e apenas pequenas alterações foram evidentes às 48 horas. A infecção por SARS-CoV-2 causou um forte aumento de PTMs de histonas repressivas (H3K9me3 e H3K27me3). Por outro lado, este efeito foi atenuado na ausência de ORF8.

Outras experiências com um SARS-CoV-2 mutante no qual o motivo ARKSAP foi deletado do ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) mostraram uma atenuação significativa dos efeitos da infecção no H3K9ac e na acessibilidade da cromatina, replicando os efeitos da deleção do ORF8. A infecção com SARS-CoV-2 de tipo selvagem reduziu a expressão de KAT2A, enquanto a infecção por SARS-CoV-2ΔARKSAP ou SARS-CoV-2ΔORF8 não o fez.

Finalmente, células alveolares pulmonares tipo II derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) (iAT2) foram infectadas com células SARS-CoV-2 de tipo selvagem e mutantes. O número de cópias do genoma dos vírus mutantes foi reduzido 48 horas após a infecção, sugerindo que o ORF8, particularmente o motivo ARKSAP, afeta a replicação do vírus. As partículas virais produzidas pelo mutante ΔORF8 foram menores que as do vírus do tipo selvagem. Em contraste, o mutante ΔARKSAP parecia ser semelhante ao SARS-CoV-2 de tipo selvagem, sugerindo que o ORF8 tem uma função independente de ARKSAP de geração de partículas virais.

Conclusões

O estudo mostrou que a ORF8 do SARS-CoV-2 contém um motivo ARKS e que a expressão da ORF8 perturba a regulação das histonas PTMs. Os pesquisadores encontraram a associação da ORF8 com proteínas associadas à cromatina, lâmina nuclear e histonas. Semelhante às histonas, a ORF8 sofre acetilação dentro do motivo imitador de histonas.

A deleção da ORF8 resultou numa redução na replicação do vírus em células iAT2, enquanto o número de cópias do genoma viral foi explicitamente afetado pela perda do motivo mimetizador de histonas. No geral, os investigadores identificaram um novo caso de mimetismo de histonas durante a infecção por SARS-CoV-2 e descreveram mecanismos pelos quais o vírus perturba a regulação da cromatina da célula hospedeira.

Referência:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z