Imitarea histonelor de către proteina SARS-CoV-2 perturbă reglarea epigenetică a celulelor gazdă

Imitarea histonelor de către proteina SARS-CoV-2 perturbă reglarea epigenetică a celulelor gazdă

Într-un studiu recent publicat în Natură Cercetătorii au arătat că o proteină coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a sindromului respirator acut sever acționează ca un imitator al histonelor pentru a perturba reglarea epigenetică a celulelor gazdă.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Dovezile actuale sugerează că infecția cu SARS-CoV-2 suprimă răspunsurile imune înnăscute și perturbă reglarea epigenetică. Cu toate acestea, cum se întâmplă acest lucru rămâne necunoscut. În cazuri rare, alți virusuri virulenți pot interfera cu reglarea epigenetică prin imitarea proteinelor gazdă, în special histonelor. Histonele împachetează ADN-ul în structuri complexe și reglează accesul la genom.

Histonele sunt supuse unui spectru de modificări post-translaționale (PTM) care sunt reglate dinamic pentru a controla expresia genelor. Mimetismul histonelor permite virușilor să perturbe capacitatea celulelor de a răspunde la infecție și de a regla expresia genelor. Cu toate acestea, imitația histonelor de către coronavirusuri (CoV) nu a fost încă validată.

Studiul și rezultatele

Prezentul studiu a investigat dacă SARS-CoV-2 folosește mimetizarea histonelor pentru a afecta reglarea cromatinei și răspunsul la infecție. În primul rând, cercetătorii au efectuat o comparație bioinformatică a proteinelor SARS-CoV-2 cu histonele umane. A existat o potrivire identică cu șase reziduuri între aminoacizii 50-55 din cadrul deschis de citire 8 (ORF8) și regiunile critice din capătul N-terminal al histonei H3.

Aceste reziduuri se află într-o regiune dezordonată de pe suprafața ORF8 monomeric. Interesant este că secvența ARKS a fost găsită în acest motiv, care este prezent în două locații diferite în coada H3. Caracterizarea proteomică a arătat că ADN-metiltransferaza 1 (DNMT1) este partenerul de legare al ORF8.

Apoi, localizarea intracelulară a ORF8 a fost examinată pentru a determina dacă funcționează ca un imitator al histonelor. Celulele HEK293T au fost transfectate cu un construct marcat cu Strep care codifică ORF8, care a fost vizualizat folosind o sondă fluorescentă. Imunofluorescența a arătat că ORF8 a fost de obicei localizat în citoplasmă și periferia nucleară.

Cu toate acestea, fracționarea celulară a arătat că este localizată atât în ​​nucleu, cât și în citoplasmă. În plus, echipa a descoperit că ORF8 s-a colocalizat cu laminele B1 și A/C în celulele transfectate. Modelul de expresie a fost confirmat în linia celulară A549 infectată cu SARS-CoV-2 care exprimă enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2). Apoi, legarea cromatinei a fost evaluată utilizând concentrații crescânde de sare. ORF8 s-a disociat de fracțiunea de cromatină la concentrații de sare similare ca laminele și histonele.

În schimb, ștergerea motivului ARKSAP în ORF8 (ORF8ΔARKSAP) a permis disocierea la concentrații mai mici de sare, sugerând că presupusul motiv imitativ al histonelor influențează puterea asocierii dintre ORF8 și cromatină. Imunoprecipitarea cromatinei cu secvențiere (ChIP-seq) a demonstrat îmbogățirea ORF8 în anumite regiuni genomice, în special cele asociate cu modificarea H3K27me3.

De asemenea, s-a descoperit că ORF8 se asociază cu lizin acetiltransferaza 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP nu a fost asociat cu proteinele cromatinei, ceea ce sugerează că motivul ARKSAP îmbunătățește asocierea ORF8 cu proteinele cromatinei. A fost efectuată o analiză spectrometrică de masă țintită pentru a investiga dacă site-ul de imitare a histonelor este modificat în mod similar cu histonele. Aceasta a identificat un reziduu de lizină în locul de mimă propus, care a fost acetilat în mod similar cu histona H3.

În plus, expresia ORF8 a provocat o scădere semnificativă a abundenței KAT2A, în timp ce proteinele laminei nucleare și nivelurile de heterocromatină asociate laminei au rămas neschimbate sau au crescut ușor. Apoi, echipa a observat că PTM-urile histonelor asociate cu reprimarea transcripțională au fost crescute în celulele HEK293T transfectate care exprimă ORF8, în timp ce cele asociate cu expresia genei active au fost epuizate. În special, cei din motivul ARKS al lui H3 au fost foarte perturbați.

Testul de cromatina accesibilă transpozazei folosind secvențierea de mare randament a arătat că ORF8 a scăzut accesibilitatea cromatinei, dar nu și ORF8ΔARKSAP. Secvențierea ARN a fost efectuată pentru a defini genele exprimate diferențial (DEG) în celulele transfectate. ORF8 și ORF8ΔARKSAP au împărtășit un subset de DEG, dar prezența motivului imitativ al histonelor a dus la modificări mai puțin dinamice ale expresiei genelor.

Genele care au fost reglate în jos ca răspuns la ORF8 în comparație cu ORF8ΔARKSAP au avut o accesibilitate mai bună a cromatinei și niveluri bazale mai mari de modificare a H3K9ac decât genele reglate în sus. Apoi, a fost generat un SARS-CoV-2 mutant fără ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); Celulele A549ACE2 au fost infectate cu acest mutant sau SARS-CoV-2 pentru a compara nivelurile genomului viral și producția de particule virale.

Nu au existat diferențe în titrurile virusului sau numărul de copii ale genomului la 24 de ore și doar modificări minore au fost evidente la 48 de ore. Infecția cu SARS-CoV-2 a provocat o creștere puternică a PTM-urilor histonelor represive (H3K9me3 și H3K27me3). În schimb, acest efect a fost atenuat în absența ORF8.

Experimente ulterioare cu un SARS-CoV-2 mutant în care motivul ARKSAP a fost șters din ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) au arătat o atenuare semnificativă a efectelor infecției asupra accesibilității H3K9ac și cromatinei, replicând efectele ștergerii ORF8. Infecția cu SARS-CoV-2 de tip sălbatic a redus expresia KAT2A, în timp ce infecția cu SARS-CoV-2ΔARKSAP sau SARS-CoV-2ΔORF8 nu a făcut-o.

În cele din urmă, celulele alveolare pulmonare de tip II (iAT2) derivate din celule stem pluripotente induse (iPSC) au fost infectate cu celule SARS-CoV-2 de tip sălbatic și mutante. Numărul de copiere a genomului de virusuri mutanți a fost redus la 48 de ore după infecție, sugerând că ORF8, în special motivul ARKSAP, afectează replicarea virusului. Particulele de virus produse de mutantul ΔORF8 au fost mai puține decât cele ale virusului de tip sălbatic. În schimb, mutantul ΔARKSAP părea a fi similar cu SARS-CoV-2 de tip sălbatic, sugerând că ORF8 are o funcție independentă de ARKSAP de generare a particulelor virale.

Concluzii

Studiul a arătat că ORF8 al SARS-CoV-2 conține un motiv ARKS și că expresia ORF8 perturbă reglarea PTM-urilor histonelor. Cercetătorii au descoperit asocierea ORF8 cu proteinele asociate cromatinei, lamina nucleară și histonele. Similar histonelor, ORF8 suferă acetilare în cadrul motivului imitativ al histonelor.

Ștergerea ORF8 a dus la o reducere a replicării virusului în celulele iAT2, în timp ce numărul de copii ale genomului viral a fost afectat în mod explicit de pierderea motivului imitativ al histonelor. În general, cercetătorii au identificat un nou caz de mimetizare a histonelor în timpul infecției cu SARS-CoV-2 și au descris mecanismele prin care virusul perturbă reglarea cromatinei celulei gazdă.

Referinţă:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z