Mimikry histónov proteínom SARS-CoV-2 narúšajú epigenetickú reguláciu hostiteľských buniek

Mimikry histónov proteínom SARS-CoV-2 narúšajú epigenetickú reguláciu hostiteľských buniek

V nedávnej štúdii publikovanej v Príroda Výskumníci ukázali, že proteín koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) ťažkého akútneho respiračného syndrómu pôsobí ako napodobenina histónu, ktorá narúša epigenetickú reguláciu hostiteľských buniek.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Súčasné dôkazy naznačujú, že infekcia SARS-CoV-2 potláča vrodené imunitné reakcie a narúša epigenetickú reguláciu. Ako sa to však deje, zostáva neznáme. V zriedkavých prípadoch môžu iné virulentné vírusy interferovať s epigenetickou reguláciou napodobňovaním hostiteľských proteínov, najmä histónov. Históny balia DNA do zložitých štruktúr a regulujú prístup ku genómu.

Históny podliehajú spektru posttranslačných modifikácií (PTM), ktoré sú dynamicky regulované na kontrolu génovej expresie. Histónová mimika umožňuje vírusom narušiť schopnosť buniek reagovať na infekciu a regulovať génovú expresiu. Napriek tomu histónová mimika koronavírusmi (CoV) ešte nebola potvrdená.

Štúdia a výsledky

Táto štúdia skúmala, či SARS-CoV-2 využíva histónovú mimiku na ovplyvnenie regulácie chromatínu a reakcie na infekciu. Najprv výskumníci vykonali bioinformatické porovnanie proteínov SARS-CoV-2 s ľudskými histónmi. Existovala identická zhoda šiestich zvyškov medzi aminokyselinami 50–55 otvoreného čítacieho rámca 8 (ORF8) a kritickými oblasťami na N-konci histónu H3.

Tieto zvyšky ležia v neusporiadanej oblasti na povrchu monomérneho ORF8. Je zaujímavé, že sekvencia ARKS sa našla v tomto motíve, ktorý je prítomný na dvoch rôznych miestach v chvoste H3. Proteomická charakterizácia odhalila, že DNA metyltransferáza 1 (DNMT1) je väzbovým partnerom ORF8.

Ďalej sa skúmala intracelulárna lokalizácia ORF8, aby sa určilo, či funguje ako napodobenina histónu. Bunky HEK293T boli transfekované konštruktom so Strep-tagom kódujúcim ORF8, ktorý bol vizualizovaný pomocou fluorescenčnej sondy. Imunofluorescencia ukázala, že ORF8 bol typicky lokalizovaný v cytoplazme a jadrovej periférii.

Bunková frakcionácia však ukázala, že sa nachádza v jadre aj v cytoplazme. Okrem toho tím zistil, že ORF8 sa kolokalizoval s laminami B1 a A/C v transfekovaných bunkách. Vzor expresie bol potvrdený v bunkovej línii A549 infikovanej SARS-CoV-2 exprimujúcej angiotenzín-konvertujúci enzým 2 (ACE2). Ďalej sa hodnotila väzba chromatínu pomocou zvyšujúcich sa koncentrácií solí. ORF8 disocioval z chromatínovej frakcie pri podobných koncentráciách solí ako laminy a históny.

Na rozdiel od toho, delécia motívu ARKSAP v ORF8 (ORF8AARKSAP) umožnila disociáciu pri nižších koncentráciách soli, čo naznačuje, že domnelý motív mimického histónu ovplyvňuje silu asociácie medzi ORF8 a chromatínom. Imunoprecipitácia chromatínu so sekvenovaním (ChIP-seq) preukázala obohatenie ORF8 v špecifických genómových oblastiach, najmä tých, ktoré sú spojené s modifikáciou H3K27me3.

Zistilo sa tiež, že ORF8 sa spája s lyzín acetyltransferázou 2A (KAT2A). ORF8AARKSAP nebol spojený s chromatínovými proteínmi, čo naznačuje, že motív ARKSAP zvyšuje asociáciu ORF8 s chromatínovými proteínmi. Uskutočnila sa cielená hmotnostná spektrometrická analýza, aby sa zistilo, či je mimické miesto histónu modifikované podobne ako históny. Toto identifikovalo lyzínový zvyšok v navrhovanom mimickom mieste, ktoré bolo acetylované podobne ako histón H3.

Okrem toho expresia ORF8 spôsobila významné zníženie množstva KAT2A, zatiaľ čo proteíny jadrovej laminy a hladiny heterochromatínu spojeného s laminou zostali nezmenené alebo sa mierne zvýšili. Ďalej tím pozoroval, že histónové PTM spojené s transkripčnou represiou boli zvýšené v transfekovaných bunkách HEK293T exprimujúcich ORF8, zatiaľ čo tie, ktoré sú spojené s aktívnou génovou expresiou, boli vyčerpané. Najmä tie v motíve ARKS H3 boli vysoko narušené.

Test chromatínu prístupného transpozázou pomocou vysokovýkonného sekvenovania ukázal, že ORF8 znížil dostupnosť chromatínu, ale nie ORF8AARKSAP. Sekvenovanie RNA sa uskutočnilo na definovanie rozdielne exprimovaných génov (DEG) v transfekovaných bunkách. ORF8 a ORF8AARKSAP zdieľali podskupinu DEG, ale prítomnosť histónového mimického motívu viedla k menej dynamickým zmenám v génovej expresii.

Gény, ktoré boli downregulované v reakcii na ORF8 v porovnaní s ORF8AARKSAP, mali lepšiu dostupnosť chromatínu a vyššie bazálne hladiny modifikácie H3K9ac ako upregulované gény. Ďalej sa vytvoril mutant SARS-CoV-2 bez ORF8 (SARS-CoV-2AORF8); Bunky A549ACE2 boli infikované týmto mutantom alebo SARS-CoV-2 na porovnanie hladín vírusového genómu a produkcie vírusových častíc.

Po 24 hodinách neboli žiadne rozdiely v titroch vírusu alebo v počte kópií genómu a po 48 hodinách boli evidentné len malé zmeny. Infekcia SARS-CoV-2 spôsobila silný nárast represívnych histónových PTM (H3K9me3 a H3K27me3). Naopak, tento účinok bol oslabený v neprítomnosti ORF8.

Ďalšie experimenty s mutantným SARS-CoV-2, v ktorých bol motív ARKSAP vymazaný z ORF8 (SARS-CoV-2AARKSAP), ukázali významné zoslabenie účinkov infekcie na dostupnosť H3K9ac a chromatínu, čím sa replikovali účinky delécie ORF8. Infekcia SARS-CoV-2 divokého typu znížila expresiu KAT2A, zatiaľ čo infekcia SARS-CoV-2AARKSAP alebo SARS-CoV-2AORF8 nie.

Nakoniec boli pľúcne alveolárne bunky typu II (iAT2) odvodené od indukovaných pluripotentných kmeňových buniek (iPSC) infikované bunkami SARS-CoV-2 divokého typu a mutantnými bunkami. Počet kópií genómu mutantných vírusov sa znížil 48 hodín po infekcii, čo naznačuje, že ORF8, najmä motív ARKSAP, ovplyvňuje replikáciu vírusu. Vírusových častíc produkovaných mutantom AORF8 bolo menej ako v prípade vírusu divokého typu. Naopak, mutant ΔARKSAP sa zdal byť podobný divokému typu SARS-CoV-2, čo naznačuje, že ORF8 má funkciu tvorby vírusových častíc nezávislú od ARKSAP.

Závery

Štúdia ukázala, že ORF8 SARS-CoV-2 obsahuje motív ARKS a že expresia ORF8 narúša reguláciu histónových PTM. Vedci našli spojenie ORF8 s proteínmi spojenými s chromatínom, jadrovou vrstvou a histónmi. Podobne ako históny, ORF8 podlieha acetylácii v motíve mimického histónu.

Delécia ORF8 viedla k zníženiu replikácie vírusu v iAT2 bunkách, zatiaľ čo počet kópií vírusového genómu bol explicitne ovplyvnený stratou histónového mimického motívu. Celkovo výskumníci identifikovali nový prípad histónovej mimikry počas infekcie SARS-CoV-2 a opísali mechanizmy, ktorými vírus narúša reguláciu chromatínu hostiteľskej bunky.

Referencia:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z