Histonmimik av SARS-CoV-2-proteinet stör den epigenetiska regleringen av värdceller

Histonmimik av SARS-CoV-2-proteinet stör den epigenetiska regleringen av värdceller

I en nyligen publicerad studie publicerad i Natur Forskare visade att ett allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) protein fungerar som en histonhärma för att störa den epigenetiska regleringen av värdceller.

Studie: SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Bildquelle: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Aktuella bevis tyder på att infektion med SARS-CoV-2 undertrycker medfödda immunsvar och stör epigenetisk reglering. Hur detta går till är dock fortfarande okänt. I sällsynta fall kan andra virulenta virus stör epigenetisk reglering genom att efterlikna värdproteiner, särskilt histoner. Histoner packar DNA i komplexa strukturer och reglerar tillgången till genomet.

Histoner är föremål för ett spektrum av posttranslationella modifieringar (PTM) som är dynamiskt reglerade för att kontrollera genuttryck. Histonmimik tillåter virus att störa cellers förmåga att svara på infektion och reglera genuttryck. Ändå har histonmimik av coronavirus (CoVs) ännu inte validerats.

Studien och resultaten

Den aktuella studien undersökte om SARS-CoV-2 använder histonmimik för att påverka kromatinreglering och infektionssvar. Först genomförde forskarna en bioinformatisk jämförelse av SARS-CoV-2-proteiner med mänskliga histoner. Det fanns en identisk matchning med sex rester mellan aminosyrorna 50–55 i öppen läsram 8 (ORF8) och de kritiska regionerna i N-terminalen av H3-histonen.

Dessa rester ligger i ett oordnat område på ytan av den monomera ORF8. Intressant nog hittades ARKS-sekvensen inom detta motiv, som finns på två olika platser i H3-svansen. Proteomisk karakterisering avslöjade att DNA-metyltransferas 1 (DNMT1) är bindningspartnern till ORF8.

Därefter undersöktes den intracellulära lokaliseringen av ORF8 för att avgöra om den fungerar som en histonhärmare. HEK293T-celler transfekterades med en Strep-märkt konstruktion som kodar för ORF8, som visualiserades med hjälp av en fluorescerande sond. Immunfluorescens visade att ORF8 typiskt var lokaliserad i cytoplasman och nukleär periferi.

Cellfraktionering visade dock att den var lokaliserad i både kärnan och cytoplasman. Dessutom fann teamet att ORF8 kolokaliserades med laminer B1 och A/C i transfekterade celler. Expressionsmönstret bekräftades i den SARS-CoV-2-infekterade A549-cellinjen som uttrycker angiotensinomvandlande enzym 2 (ACE2). Därefter utvärderades kromatinbindning med användning av ökande saltkoncentrationer. ORF8 dissocierade från kromatinfraktionen vid liknande saltkoncentrationer som laminer och histoner.

Däremot möjliggjorde deletion av ARKSAP-motivet i ORF8 (ORF8ΔARKSAP) dissociation vid lägre saltkoncentrationer, vilket tyder på att det förmodade histonhärmande motivet påverkar styrkan av association mellan ORF8 och kromatin. Kromatinimmunutfällning med sekvensering (ChIP-seq) visade anrikningen av ORF8 inom specifika genomiska regioner, särskilt de som är associerade med H3K27me3-modifieringen.

ORF8 visade sig också associera med lysinacetyltransferas 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP var inte associerad med kromatinproteiner, vilket tyder på att ARKSAP-motivet förbättrar associationen av ORF8 med kromatinproteiner. En riktad masspektrometrisk analys utfördes för att undersöka om histonhärmarplatsen är modifierad på samma sätt som histoner. Detta identifierade en lysinrest i det föreslagna mimikstället som acetylerades på liknande sätt som H3-histon.

Dessutom orsakade ORF8-uttryck en signifikant minskning av KAT2A-överflöd, medan nukleära laminaproteiner och laminaassocierade heterokromatinnivåer förblev oförändrade eller ökade något. Därefter observerade teamet att histon-PTMs associerade med transkriptionell repression ökade i transfekterade HEK293T-celler som uttrycker ORF8, medan de som är associerade med aktivt genuttryck var utarmade. I synnerhet var de inom ARKS-motivet av H3 kraftigt störda.

Den transposastillgängliga kromatinanalysen med sekvensering med hög genomströmning visade att ORF8 minskade kromatintillgängligheten, men inte ORF8ΔARKSAP. RNA-sekvensering utfördes för att definiera differentiellt uttryckta gener (DEG) i transfekterade celler. ORF8 och ORF8ΔARKSAP delade en delmängd av DEG, men närvaron av histonmimikmotivet resulterade i mindre dynamiska förändringar i genuttryck.

Gener som nedreglerades som svar på ORF8 jämfört med ORF8ΔARKSAP hade bättre kromatintillgänglighet och högre basala nivåer av H3K9ac-modifiering än uppreglerade gener. Därefter genererades en mutant SARS-CoV-2 som saknade ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8); A549ACE2-celler infekterades med denna mutant eller SARS-CoV-2 för att jämföra virala genomnivåer och viral partikelproduktion.

Det fanns inga skillnader i virustiter eller genomkopiatal vid 24 timmar, och endast mindre förändringar var uppenbara vid 48 timmar. SARS-CoV-2-infektion orsakade en kraftig ökning av repressiva histon-PTM (H3K9me3 och H3K27me3). Omvänt försvagades denna effekt i frånvaro av ORF8.

Ytterligare experiment med en mutant SARS-CoV-2 där ARKSAP-motivet raderades från ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) visade en signifikant dämpning av effekterna av infektion på H3K9ac och kromatintillgänglighet, vilket replikerade effekterna av ORF8-deletion. Infektion med SARS-CoV-2 av vildtyp reducerade KAT2A-uttryck, medan SARS-CoV-2ΔARKSAP eller SARS-CoV-2ΔORF8-infektion inte gjorde det.

Slutligen inducerades pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda typ II lungalveolära celler (iAT2) infekterade med vildtyps- och mutanta SARS-CoV-2-celler. Genomkopieringsantalet för mutanta virus minskade 48 timmar efter infektion, vilket tyder på att ORF8, särskilt ARKSAP-motivet, påverkar virusreplikationen. Viruspartiklarna som producerades av ΔORF8-mutanten var färre än de från vildtypsviruset. Däremot verkade ΔARKSAP-mutanten likna vildtyp SARS-CoV-2, vilket tyder på att ORF8 har en ARKSAP-oberoende funktion för generering av viral partikel.

Slutsatser

Studien visade att ORF8 av SARS-CoV-2 innehåller ett ARKS-motiv och att uttryck av ORF8 stör regleringen av histon-PTM. Forskarna fann sambandet mellan ORF8 med kromatinassocierade proteiner, nukleär lamina och histoner. I likhet med histoner genomgår ORF8 acetylering inom histonmimikmotivet.

Borttagning av ORF8 resulterade i en minskning av virusreplikationen i iAT2-celler, medan det virala genomets kopianummer explicit påverkades av förlust av histonhärmandemotivet. Sammantaget identifierade forskarna ett nytt fall av histonmimik under SARS-CoV-2-infektion och beskrev mekanismer genom vilka viruset stör värdcellskromatinreglering.

Hänvisning:

• Kee J, Thudium S, Renner DM, et al. (2022). SARS-CoV-2 stört die epigenetische Regulation des Wirts durch Histon-Mimikry. Natur. doi: 10.1038/s41586-022-05282-z https://www.nature.com/articles/s41586-022-05282-z