Тестване на място за високочувствителни вируси на маймунска шарка с помощта на CRISPR/Cas12a

Тестване на място за високочувствителни вируси на маймунска шарка с помощта на CRISPR/Cas12a

Вирусът на маймунската шарка (MPXV), изолиран за първи път през 1958 г., е двойноверижен ДНК (dsDNA) вирус. Когато през 1970 г. в Демократична република Конго е открит първият случай на заразяване с хора, болестта е призната за зооноза. В момента има глобална загриженост относно MPXV поради широко разпространеното предаване от Централна и Западна Африка.

За да се ограничи разпространението на този вирус, бързото, високочувствително и специфично откриване е от съществено значение. В ново проучване, публикувано в medRxiv * Сървър за предпечат: Изследователи в Китай разработиха за първи път MPXV анализ, който съчетава клъстерирани, редовно разположени къси палиндромни повторения и CRISPR-асоцииран протеин (CRISPR/Cas) и рекомбиназа-асистирана амплификация (RAA). Анализът показа висока селективност и може да направи разлика между MPXV и други ортопоксвируси.

проучване: CRISPR/Cas12a-медиирано високочувствително тестване на място за вирус на маймунска шарка. Източник на изображението: Dotted Yeti / Shutterstock

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

фон

Понастоящем MPXV тестването използва методи като ензимен имуноанализ (ELISA), полимеразна верижна реакция (PCR) и изотермична амплификация, медиирана от бримка (LAMP). PCR е златен стандарт и е точен и чувствителен, но труден за използване в райони с бедни ресурси. ELISA може да даде фалшиво положителни резултати при скорошна или далечна ваксинация, а недостатъците на LAMP са свързани със сложния дизайн на праймера, лошото количествено представяне и т.н. Понастоящем липсват бързи, свръхчувствителни и рентабилни методи, които улесняват лесното откриване на MPXV на място.

Относно изследването

CRISPR/Cas е открит за първи път в адаптивната имунна система на прокариотите. Системата CRISPR/Cas12a интегрира сигнална трансдукция и биодетекция е използвана за откриване на няколко вируса, включително коронавирус 2 на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV-2). Той предлага много предимства, свързани с меки условия, висока чувствителност, лесна работа и мощно усилване на сигнала.

Към днешна дата не са докладвани критични проблеми, свързани с използването на технологията CRISPR при откриване на MPXV, като: B. Скрининг на сонда, аналитична производителност, предварително усилване и тестване на място (POCT). Следователно, настоящото проучване предложи за първи път бърз и високочувствителен анализ, който съчетава амплификация, подпомагана от рекомбиназа (RAA) и CRISPR/Cas12a, т.е. RAA-Cas12a-MPXV анализ. Принципът включва три стъпки: усилване на RAA, разцепване на CRISPR/Cas12a и извеждане на сигнала.

Ключови резултати

В първата стъпка RAA селекцията на ДНК шаблона генерира голям брой ампликони. Това значително увеличи чувствителността на анализа. Във втората стъпка се активира активността на транс-разцепване на Cas12a, което води до разцепването на множество ssDNA репортери. Последната стъпка доведе до два различни режима на изходен сигнал: FQ репортерен флуоресцентен анализ и лента за страничен поток, което подобри използваемостта и пригодността на RAA-Cas12a-MPXV анализа.

Резултатите от флуоресценцията с или без ДНК шаблони и RAA продукта бяха сравнени, за да се оцени осъществимостта на анализа. Групата без ДНК беше контролата, която не показа значителна промяна на флуоресценцията. Това показва, че в отсъствието на ДНК шаблони не е генериран RAA ампликон, който може да бъде разпознат от последващи CRISPR/Cas12a.

За да се осигури по-висока селективност и чувствителност, бяха проектирани три двойки праймери, които се свързват с различни места на MPXV-специфичния F3L ген. За да се намерят оптималните праймери за бъдещи експерименти, бяха извършени RAA-Cas12a-MPXV флуоресцентен анализ и електрофореза в агарозен гел (AGE). Третата двойка (F2+R2) достигна най-ярката специфична лента на усилване.

Много важни експериментални условия, свързани със системата CRISPR/Cas12a и анализа RAA-Cas12a-MPXV, бяха оптимизирани, като температурата и времето за реакция на RAA бяха основният фокус. След това системата CRISPR/Cas12a беше оптимизирана с crRNA2.

Флуоресцентният анализ RAA-Cas12a-MPXV се счита за лесен за използване и подходящ за бързо тестване. В сравнение с PCR-Cas12a-MPXV флуоресцентния анализ, RAA-Cas12a-MPXV флуоресцентният анализ демонстрира отлична чувствителност с 1000-кратна долна граница на откриване (LOD).

Селективността на анализа на флуоресценцията на RAA-Cas12a-MPXV се определя чрез сравняване на нивото на флуоресценция, произведена от MPXV с други вируси като вирус на вариола (VARV), вирус на кравешка шарка (CPXV) и коронавирус-2 на тежък остър респираторен синдром (SARS-). CoV-2), вирус на Toxoplasma Gondii (TOXV) и вирус на африканска чума по свинете (ASFV). Както наблюдението с невъоръжено око, така и стойностите на флуоресценцията показват, че само MPXV индуцира повишена флуоресценция, докато други вируси не.

FAM-биотиновият репортер (FB репортер) е разработен като заместител на FQ репортера на флуоресцентния анализ и впоследствие е създаден RAA-Cas12a-MPXV анализ на ленти за страничен поток за POCT. Добавянето на реакционен разтвор, съдържащ непокътнати FB репортери, разруши FAMs и биотин в подложките на пробите и предизвика бързо свързване на анти-FAM антитяло/AuNP комплекси с изолирани FAMs и FB репортери, докато пробата мигрира напред. И накрая, стрептавидин, имобилизиран върху контролната лента, улавя разцепените биотини и комплексите FB репортер/анти-FAM антитяло/AuNP.

Първоначално контролната лента изглеждаше червена поради агрегацията на AuNP. Впоследствие останалите изолирани FAM/анти-FAM антитяло/AuNP комплекси мигрираха към тестовата лента и реагираха с FAM антитела, изглеждащи червени. Накрая ампликоните активираха Cas12a, за да разцепи всички FB репортери. Промяната на цвета се запази само върху тестовата лента.

Накратко, ако промяната на цвета се наблюдава само в тестовата лента или както в контролната, така и в тестовата лента, това се счита за положителен резултат. От друга страна, ако промяната на цвета се наблюдава само върху контролната лента, това показва отрицателен резултат, т.е. липсата на ДНК шаблони доведе до липса на ампликони за активиране на Cas12a.

Изводи

Ключово предимство на анализа RAA-Cas12a-MPXV е, че може да се извърши при лека температура в сравнение с традиционните методи. Важно е, че този анализ е мощен MPXV диагностичен метод с превъзходна селективност, чувствителност и преносимост.

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

препратки:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Ревизии на статиите

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.