Test på stedet for meget følsomme abekoppevirus ved hjælp af CRISPR/Cas12a

Test på stedet for meget følsomme abekoppevirus ved hjælp af CRISPR/Cas12a

Abekoppevirus (MPXV), som først blev isoleret i 1958, er et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) virus. Da det første menneskelige tilfælde blev opdaget i Den Demokratiske Republik Congo i 1970, blev sygdommen anerkendt som en zoonotisk sygdom. Der er i øjeblikket global bekymring for MPXV på grund af udbredt transmission fra Central- og Vestafrika.

For at begrænse spredningen af ​​denne virus er hurtig, meget følsom og specifik detektion afgørende. I en ny undersøgelse offentliggjort i medRxiv * Preprint-server: Forskere i Kina har for første gang udviklet et MPXV-assay, der kombinerer clustered, regelmæssigt adskilte korte palindromiske gentagelser og CRISPR-associeret protein (CRISPR/Cas) og rekombinase-assisteret amplifikation (RAA). Assayet viste høj selektivitet og kunne skelne mellem MPXV og andre orthopoxvirus.

Studere: CRISPR/Cas12a-medieret høj-sensitiv on-site monkeypox virus test. Billedkilde: Dotted Yeti / Shutterstock

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

baggrund

I øjeblikket anvender MPXV-test metoder såsom enzymimmunoassay (ELISA), polymerasekædereaktion (PCR) og loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP). PCR er guldstandarden og er præcis og følsom, men svær at bruge i ressourcesvage områder. ELISA kunne give falske positive resultater ved nylig eller fjern vaccination, og ulemperne ved LAMP er relateret til kompliceret primerdesign, dårlig kvantitativ ydeevne osv. Hurtige, ultrafølsomme og omkostningseffektive metoder, der letter on-site og nem detektion af MPXV, mangler i øjeblikket.

Om studiet

CRISPR/Cas blev først opdaget i det adaptive immunsystem af prokaryoter. CRISPR/Cas12a-systemet integrerer signaltransduktion, og biodetektion er blevet brugt til at detektere adskillige vira, herunder alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det giver mange fordele relateret til milde forhold, høj følsomhed, nem betjening og kraftig signalforstærkning.

Til dato er der ikke rapporteret kritiske problemer relateret til brugen af ​​CRISPR-teknologi i MPXV-detektion, såsom: B. Probescreening, analytisk ydeevne, præ-amplifikation og point-of-care test (POCT). Derfor foreslog den nuværende undersøgelse for første gang et hurtigt og meget følsomt assay, der kombinerer rekombinase-assisteret amplifikation (RAA) og CRISPR/Cas12a, dvs. RAA-Cas12a-MPXV assayet. Princippet involverede tre trin: RAA-forstærkning, CRISPR/Cas12a-spaltning og signaloutput.

Nøgleresultater

I det første trin genererede RAA-selektion af DNA-skabelonen et stort antal amplikoner. Dette øgede analysens følsomhed betydeligt. I det andet trin blev trans-spaltningsaktiviteten af ​​Cas12a aktiveret, hvilket førte til spaltningen af ​​adskillige ssDNA-reportere. Det sidste trin resulterede i to forskellige signaludgangstilstande: FQ reporter fluorescensassay og lateral flow strip, som forbedrede anvendeligheden og egnetheden af ​​RAA-Cas12a-MPXV assayet.

Fluorescensresultater med eller uden DNA-skabeloner og RAA-produktet blev sammenlignet for at evaluere assayets gennemførlighed. Gruppen uden DNA var kontrollen, som ikke viste nogen signifikant fluorescensændring. Dette indikerede, at der i fravær af DNA-skabeloner ikke blev genereret noget RAA-amplikon, der kunne genkendes af efterfølgende CRISPR/Cas12a.

For at sikre højere selektivitet og følsomhed blev tre primerpar designet, som bandt til forskellige steder i det MPXV-specifikke F3L-gen. For at finde de optimale primere til fremtidige eksperimenter blev RAA-Cas12a-MPXV fluorescensassay og agarosegelelektroforese (AGE) udført. Det tredje par (F2+R2) nåede det lyseste specifikke forstærkningsbånd.

Mange vigtige eksperimentelle forhold relateret til CRISPR/Cas12a-systemet og RAA-Cas12a-MPXV-analysen blev optimeret, hvor temperaturen og reaktionstiden for RAA var det primære fokus. Dernæst blev CRISPR/Cas12a-systemet optimeret med crRNA2.

RAA-Cas12a-MPXV fluorescensanalysen blev anset for let at bruge og egnet til hurtig test. Sammenlignet med PCR-Cas12a-MPXV-fluorescensassayet viste RAA-Cas12a-MPXV-fluorescensassayet fremragende følsomhed med en 1000 gange nedre detektionsgrænse (LOD).

Selektiviteten af ​​RAA-Cas12a-MPXV fluorescensanalysen blev bestemt ved at sammenligne niveauet af fluorescens produceret af MPXV med andre vira, såsom variolavirus (VARV), kokoppevirus (CPXV) og alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus-2 (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii-virus (TOXV) og afrikansk svinepest-virus (ASFV). Både observation med det blotte øje og fluorescensværdier viste, at kun MPXV inducerede forbedret fluorescens, mens andre vira ikke gjorde det.

FAM-biotin-reporteren (FB-reporteren) blev udviklet som en erstatning for FQ-reporteren af ​​fluorescensassayet, og efterfølgende blev RAA-Cas12a-MPXV lateral flow strip-analysen for POCT etableret. Tilsætning af en reaktionsopløsning indeholdende intakte FB-reportere forstyrrede FAM'er og biotin i prøvepuderne og forårsagede hurtig binding af anti-FAM-antistof/AuNP-komplekserne med isolerede FAM'er og FB-reportere, da prøven migrerede fremad. Endelig immobiliserede streptavidin på kontrolbåndet fangede spaltede biotiner og FB reporter/anti-FAM antistof/AuNP komplekserne.

Indledningsvis så kontrolbåndet rødt på grund af aggregeringen af ​​AuNP'er. Efterfølgende migrerede resten af ​​de isolerede FAM/anti-FAM-antistof/AuNP-komplekser til testbåndet og reagerede med FAM-antistoffer, der så røde ud. Endelig aktiverede amplicons Cas12a for at spalte alle FB-reportere. Farveændringen fortsatte kun på testbåndet.

Kort sagt, hvis farveændringen kun blev observeret i testbåndet eller i både kontrol- og testbåndet, blev det betragtet som et positivt resultat. På den anden side, hvis farveændringen kun blev observeret på kontrolbåndet, indikerede dette et negativt resultat, dvs. manglen på DNA-skabeloner resulterede i ingen amplikoner for Cas12a-aktivering.

Konklusioner

En vigtig fordel ved RAA-Cas12a-MPXV-analysen er, at den kan udføres ved en mild temperatur sammenlignet med traditionelle metoder. Det er vigtigt, at denne analyse var en kraftfuld MPXV diagnostisk metode med overlegen selektivitet, følsomhed og bærbarhed.

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Referencer:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Artikel revisioner

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.