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Pruebas in situ para virus de la viruela del simio altamente sensibles mediante CRISPR/Cas12a
El virus de la viruela del simio (MPXV), aislado por primera vez en 1958, es un virus de ADN bicatenario (ADNbc). Cuando se detectó el primer caso humano en la República Democrática del Congo en 1970, la enfermedad fue reconocida como zoonótica. Actualmente existe preocupación mundial sobre el MPXV debido a la transmisión generalizada desde África central y occidental. Para contener la propagación de este virus, es fundamental una detección rápida, altamente sensible y específica. En un nuevo estudio publicado en el servidor de preimpresión medRxiv*: Investigadores en China han desarrollado por primera vez un ensayo MPXV que combina repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas y proteína asociada a CRISPR (CRISPR/Cas) y amplificación asistida por recombinasa (RAA). El …
Pruebas in situ para virus de la viruela del simio altamente sensibles mediante CRISPR/Cas12a
El virus de la viruela del simio (MPXV), aislado por primera vez en 1958, es un virus de ADN bicatenario (ADNbc). Cuando se detectó el primer caso humano en la República Democrática del Congo en 1970, la enfermedad fue reconocida como zoonótica. Actualmente existe preocupación mundial sobre el MPXV debido a la transmisión generalizada desde África central y occidental.
Para contener la propagación de este virus, es fundamental una detección rápida, altamente sensible y específica. En un nuevo estudio publicado en el medRxiv * Servidor de preimpresión: investigadores en China han desarrollado por primera vez un ensayo MPXV que combina repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas y proteína asociada a CRISPR (CRISPR/Cas) y amplificación asistida por recombinasa (RAA). El ensayo mostró una alta selectividad y pudo distinguir entre MPXV y otros ortopoxvirus.
Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes
fondo
Actualmente, las pruebas de MPXV utilizan métodos como el inmunoensayo enzimático (ELISA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). La PCR es el estándar de oro y es precisa y sensible, pero difícil de utilizar en zonas de escasos recursos. ELISA podría dar resultados falsos positivos en vacunación reciente o a distancia, y las desventajas de LAMP están relacionadas con un diseño de cebador complicado, un rendimiento cuantitativo deficiente, etc. Actualmente faltan métodos rápidos, ultrasensibles y rentables que faciliten la detección sencilla e in situ del MPXV.
Sobre el estudio
CRISPR/Cas se descubrió por primera vez en el sistema inmunológico adaptativo de los procariotas. El sistema CRISPR/Cas12a integra transducción de señales y biodetección se ha utilizado para detectar varios virus, incluido el coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2). Ofrece muchas ventajas relacionadas con condiciones suaves, alta sensibilidad, fácil operación y potente amplificación de señal.
Hasta la fecha, no se han informado problemas críticos relacionados con el uso de la tecnología CRISPR en la detección de MPXV, como por ejemplo: detección de sondas, rendimiento analítico, preamplificación y pruebas en el punto de atención (POCT). Por lo tanto, el estudio actual propuso por primera vez un ensayo rápido y altamente sensible que combina amplificación asistida por recombinasa (RAA) y CRISPR/Cas12a, es decir, el ensayo RAA-Cas12a-MPXV. El principio implicó tres pasos: amplificación RAA, escisión CRISPR/Cas12a y salida de señal.
Resultados clave
En el primer paso, la selección RAA de la plantilla de ADN generó una gran cantidad de amplicones. Esto aumentó significativamente la sensibilidad del ensayo. En el segundo paso, se activó la actividad de transescisión de Cas12a, lo que provocó la escisión de numerosos informadores de ADN ss. El paso final dio como resultado dos modos de salida de señal diferentes: ensayo de fluorescencia del indicador FQ y tira de flujo lateral, lo que mejoró la usabilidad y la idoneidad del ensayo RAA-Cas12a-MPXV.
Se compararon los resultados de fluorescencia con o sin plantillas de ADN y el producto RAA para evaluar la viabilidad del ensayo. El grupo sin ADN fue el control, que no mostró cambios significativos de fluorescencia. Esto indicó que, en ausencia de plantillas de ADN, no se generó ningún amplicón RAA que pudiera ser reconocido por CRISPR/Cas12a posterior.
Para garantizar una mayor selectividad y sensibilidad, se diseñaron tres pares de cebadores que se unían a diferentes sitios del gen F3L específico de MPXV. Para encontrar los cebadores óptimos para experimentos futuros, se realizaron un ensayo de fluorescencia RAA-Cas12a-MPXV y electroforesis en gel de agarosa (AGE). El tercer par (F2+R2) alcanzó la banda de ganancia específica más brillante.
Se optimizaron muchas condiciones experimentales importantes relacionadas con el sistema CRISPR/Cas12a y el ensayo RAA-Cas12a-MPXV, siendo la temperatura y el tiempo de reacción de RAA el enfoque principal. A continuación, se optimizó el sistema CRISPR/Cas12a con crRNA2.
El ensayo de fluorescencia RAA-Cas12a-MPXV se consideró fácil de usar y adecuado para pruebas rápidas. En comparación con el ensayo de fluorescencia PCR-Cas12a-MPXV, el ensayo de fluorescencia RAA-Cas12a-MPXV demostró una sensibilidad excelente con un límite de detección (LOD) 1000 veces inferior.
La selectividad del ensayo de fluorescencia RAA-Cas12a-MPXV se determinó comparando el nivel de fluorescencia producida por MPXV con otros virus como el virus variola (VARV), el virus de la viruela vacuna (CPXV) y el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-). CoV-2), el virus Toxoplasma Gondii (TOXV) y el virus de la peste porcina africana (ASFV). Tanto la observación a simple vista como los valores de fluorescencia mostraron que solo el MPXV inducía una fluorescencia mejorada, mientras que otros virus no lo hacían.
El indicador FAM-biotina (reportero FB) se desarrolló como reemplazo del indicador FQ del ensayo de fluorescencia y posteriormente se estableció el ensayo de tira de flujo lateral RAA-Cas12a-MPXV para POCT. La adición de una solución de reacción que contenía reporteros FB intactos interrumpió los FAM y la biotina en las almohadillas de muestra y provocó una unión rápida de los complejos de anticuerpo anti-FAM/AuNP con FAM aislados y reporteros FB a medida que la muestra migraba hacia adelante. Finalmente, la estreptavidina inmovilizada en la banda de control capturó biotinas escindidas y los complejos reportero FB/anticuerpo anti-FAM/AuNP.
Inicialmente, la banda de control apareció en rojo debido a la agregación de AuNP. Posteriormente, el resto de los complejos FAM/anticuerpo anti-FAM/AuNP aislados migraron a la banda de prueba y reaccionaron con anticuerpos FAM que aparecían en rojo. Finalmente, los amplicones activaron Cas12a para escindir a todos los reporteros de FB. El cambio de color sólo persistió en la cinta de prueba.
Brevemente, si el cambio de color se observó sólo en la banda de prueba o tanto en la banda de control como en la de prueba, se consideró un resultado positivo. Por otro lado, si el cambio de color solo se observó en la banda de control, esto indicó un resultado negativo, es decir h. la falta de plantillas de ADN no resultó en amplicones para la activación de Cas12a.
Conclusiones
Una ventaja clave del ensayo RAA-Cas12a-MPXV es que se puede realizar a una temperatura suave en comparación con los métodos tradicionales. Es importante destacar que este ensayo fue un potente método de diagnóstico de MPXV con selectividad, sensibilidad y portabilidad superiores.
Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes
Referencias:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.
Revisiones de artículos
- 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.