Väga tundlike ahvirõugete viiruste kohapealne testimine, kasutades CRISPR/Cas12a

Väga tundlike ahvirõugete viiruste kohapealne testimine, kasutades CRISPR/Cas12a

Ahvirõugeviirus (MPXV), mis eraldati esmakordselt 1958. aastal, on kaheahelaline DNA (dsDNA) viirus. Kui Kongo Demokraatlikus Vabariigis 1970. aastal tuvastati esimene haigusjuht, tunnistati haigus zoonootiliseks haiguseks. Praegu on ülemaailmne mure MPXV pärast Kesk- ja Lääne-Aafrikast laialt levinud leviku tõttu.

Selle viiruse leviku tõkestamiseks on oluline kiire, väga tundlik ja spetsiifiline avastamine. Uues uuringus, mis avaldati medRxiv * Preprintserver: Hiina teadlased on esmakordselt välja töötanud MPXV testi, mis ühendab rühmitatud, korrapäraste vahedega lühikesed palindroomsed kordused ja CRISPR-iga seotud valgu (CRISPR/Cas) ja rekombinaasiga toetatud amplifikatsiooni (RAA). Analüüs näitas suurt selektiivsust ja eristas MPXV-d teistest ortopoksviirustest.

Uuring: CRISPR/Cas12a-vahendatud kõrge tundlikkusega kohapealne ahvirõugete viiruse testimine. Pildi allikas: Dotted Yeti / Shutterstock

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

taustal

Praegu kasutatakse MPXV testimisel selliseid meetodeid nagu ensüümi immunoanalüüs (ELISA), polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja loop-mediated isothermal amplification (LAMP). PCR on kullastandard ning täpne ja tundlik, kuid raskesti kasutatav ressursivaestes piirkondades. ELISA võib anda valepositiivseid tulemusi hiljutisel või kaugemal tehtud vaktsineerimisel ning LAMP-i puudused on seotud keerulise praimerite disaini, halva kvantitatiivse jõudlusega jne. Hetkel puuduvad kiired, ülitundlikud ja kulutõhusad meetodid, mis hõlbustavad MPXV kohapealset ja lihtsat tuvastamist.

Uuringu kohta

CRISPR/Cas avastati esmakordselt prokarüootide adaptiivses immuunsüsteemis. CRISPR/Cas12a süsteem integreerib signaaliülekande ja biotuvastust on kasutatud mitmete viiruste, sealhulgas raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) tuvastamiseks. Sellel on palju eeliseid, mis on seotud kergete tingimuste, kõrge tundlikkuse, lihtsa kasutamise ja võimsa signaalivõimendusega.

Siiani ei ole teatatud ühestki kriitilisest probleemist, mis on seotud CRISPR-tehnoloogia kasutamisega MPXV tuvastamisel, näiteks: B. Sondi sõelumine, analüütiline jõudlus, eelvõimendus ja hoolduspunkti testimine (POCT). Seetõttu pakkus käesolev uuring esimest korda välja kiire ja ülitundliku analüüsi, mis ühendab rekombinaasi abil amplifikatsiooni (RAA) ja CRISPR/Cas12a, st RAA-Cas12a-MPXV analüüsi. Põhimõte hõlmas kolme etappi: RAA võimendus, CRISPR/Cas12a lõhustamine ja signaali väljund.

Peamised tulemused

Esimeses etapis genereeris DNA matriitsi RAA valik suure hulga amplikone. See suurendas oluliselt analüüsi tundlikkust. Teises etapis aktiveeriti Cas12a trans-lõhustamise aktiivsus, mis viis paljude ssDNA reporterite lõhustamiseni. Viimase etapi tulemuseks oli kaks erinevat signaali väljundrežiimi: FQ reporteri fluorestsentsanalüüs ja külgvoolu riba, mis parandas RAA-Cas12a-MPXV testi kasutatavust ja sobivust.

Analüüsi teostatavuse hindamiseks võrreldi fluorestsentsi tulemusi DNA matriitidega või ilma ja RAA produktiga. DNA-ta rühm oli kontroll, mis ei näidanud olulist fluorestsentsi muutust. See näitas, et DNA mallide puudumisel ei loodud RAA amplikonit, mida oleks võimalik ära tunda järgneva CRISPR / Cas12a abil.

Suurema selektiivsuse ja tundlikkuse tagamiseks kavandati kolm praimeripaari, mis seostusid MPXV-spetsiifilise F3L geeni erinevate saitidega. Tulevaste katsete jaoks optimaalsete praimerite leidmiseks viidi läbi RAA-Cas12a-MPXV fluorestsentsanalüüs ja agaroosgeelelektroforees (AGE). Kolmas paar (F2+R2) saavutas eredaima erivõimendusriba.

Paljud olulised CRISPR / Cas12a süsteemi ja RAA-Cas12a-MPXV testiga seotud katsetingimused optimeeriti, kusjuures esmaseks fookuseks oli RAA temperatuur ja reaktsiooniaeg. Järgmisena optimeeriti CRISPR / Cas12a süsteem crRNA2-ga.

RAA-Cas12a-MPXV fluorestsentsanalüüsi peeti hõlpsasti kasutatavaks ja kiirtestimiseks sobivaks. Võrreldes PCR-Cas12a-MPXV fluorestsentsanalüüsiga näitas RAA-Cas12a-MPXV fluorestsentsanalüüs suurepärast tundlikkust 1000-kordse tuvastamispiiriga (LOD).

RAA-Cas12a-MPXV fluorestsentsanalüüsi selektiivsus määrati MPXV tekitatud fluorestsentsi taseme võrdlemisel teiste viirustega, nagu variola viirus (VARV), lehmarõugeviirus (CPXV) ja raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus-2 (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii viirus (TOXV) ja sigade Aafrika katku viirus (ASFV). Nii palja silmaga vaatlus kui ka fluorestsentsi väärtused näitasid, et ainult MPXV indutseeris suurenenud fluorestsentsi, teised viirused aga mitte.

FAM-biotiini reporter (FB reporter) töötati välja fluorestsentsanalüüsi FQ reporteri asendajana ja seejärel loodi POCT jaoks RAA-Cas12a-MPXV külgvoolu riba test. Intaktseid FB reportereid sisaldava reaktsioonilahuse lisamine katkestas proovipadjandites FAM-id ja biotiini ning põhjustas FAM-vastase antikeha/AuNP komplekside kiire seondumise isoleeritud FAM-ide ja FB reporteritega, kui proov edasi liikus. Lõpuks püüdis kontrollribale immobiliseeritud streptavidiin lõhustatud biotiinid ja FB reporter / anti-FAM antikeha / AuNP kompleksid.

Algselt näis kontrollriba AuNP-de agregatsiooni tõttu punane. Seejärel migreerusid ülejäänud eraldatud FAM/anti-FAM antikeha/AuNP kompleksid testribale ja reageerisid punaste FAM-antikehadega. Lõpuks aktiveerisid amplikonid Cas12a, et lõhustada kõik FB reporterid. Värvimuutus püsis ainult testlindil.

Lühidalt, kui värvimuutust täheldati ainult katseribas või nii kontroll- kui ka testiribas, loeti see positiivseks tulemuseks. Teisest küljest, kui värvimuutust täheldati ainult kontrollribal, näitas see negatiivset tulemust, st h. DNA mallide puudumine ei põhjustanud Cas12a aktiveerimiseks amplikone.

Järeldused

RAA-Cas12a-MPXV testi peamine eelis on see, et seda saab traditsiooniliste meetoditega võrreldes läbi viia madalal temperatuuril. Oluline on see, et see test oli võimas MPXV diagnostikameetod, millel on suurepärane selektiivsus, tundlikkus ja kaasaskantavus.

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

Viited:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Artiklite redaktsioonid

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.