Paikan päällä testataan erittäin herkkiä apinarokkoviruksia käyttämällä CRISPR/Cas12a

Paikan päällä testataan erittäin herkkiä apinarokkoviruksia käyttämällä CRISPR/Cas12a

Monkeypox-virus (MPXV), joka eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1958, on kaksijuosteinen DNA (dsDNA) -virus. Kun Kongon demokraattisessa tasavallassa vuonna 1970 havaittiin ensimmäinen ihmistartunta, tauti tunnustettiin zoonoottiseksi taudiksi. MPXV:stä ollaan tällä hetkellä maailmanlaajuisesti huolissaan Keski- ja Länsi-Afrikasta laajalle levinneen leviämisen vuoksi.

Tämän viruksen leviämisen estämiseksi nopea, erittäin herkkä ja tarkka havaitseminen on välttämätöntä. Uudessa tutkimuksessa, joka julkaistiin medRxiv * Preprint-palvelin: Kiinalaiset tutkijat ovat kehittäneet ensimmäistä kertaa MPXV-määrityksen, joka yhdistää klusteroituja, säännöllisin väliajoin olevia lyhyitä palindromisia toistoja ja CRISPR:ään liittyvää proteiinia (CRISPR/Cas) ja rekombinaasiavusteista monistusta (RAA). Määritys osoitti suurta selektiivisyyttä ja pystyi erottamaan MPXV:n muista ortopoksiviruksista.

Tutkimus: CRISPR/Cas12a-välitteinen erittäin herkkä apinapox-virustestaus paikan päällä. Kuvan lähde: Dotted Yeti / Shutterstock

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

tausta

Tällä hetkellä MPXV-testauksessa käytetään menetelmiä, kuten entsyymi-immunomääritys (ELISA), polymeraasiketjureaktio (PCR) ja silmukkavälitteinen isoterminen monistus (LAMP). PCR on kultainen standardi, ja se on tarkka ja herkkä, mutta vaikea käyttää resurssiköyhillä alueilla. ELISA voi antaa vääriä positiivisia tuloksia viimeaikaisissa tai kaukaisissa rokotuksissa, ja LAMP:n haitat liittyvät monimutkaiseen alukkeiden suunnitteluun, huonoon kvantitatiiviseen suorituskykyyn jne. Tällä hetkellä puuttuu nopeita, erittäin herkkiä ja kustannustehokkaita menetelmiä, jotka helpottavat MPXV:n paikantamista ja helppoa havaitsemista.

Tietoja tutkimuksesta

CRISPR/Cas löydettiin ensimmäisen kerran prokaryoottien adaptiivisesta immuunijärjestelmästä. CRISPR/Cas12a-järjestelmä integroi signaalinsiirron, ja biodetektiota on käytetty useiden virusten havaitsemiseen, mukaan lukien vakava akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2). Se tarjoaa monia etuja, jotka liittyvät lieviin olosuhteisiin, korkeaan herkkyyteen, helppokäyttöisyyteen ja tehokkaaseen signaalinvahvistukseen.

Tähän mennessä ei ole raportoitu kriittisiä ongelmia, jotka liittyvät CRISPR-teknologian käyttöön MPXV-detektiossa, kuten: B. Anturin seulonta, analyyttinen suorituskyky, esivahvistus ja hoitopistetestaus (POCT). Siksi nykyinen tutkimus ehdotti ensimmäistä kertaa nopeaa ja erittäin herkkää määritystä, joka yhdistää rekombinaasiavusteisen amplifikaation (RAA) ja CRISPR/Cas12a:n, eli RAA-Cas12a-MPXV-määrityksen. Periaate sisälsi kolme vaihetta: RAA-vahvistus, CRISPR/Cas12a-katkaisu ja signaalin ulostulo.

Tärkeimmät tulokset

Ensimmäisessä vaiheessa DNA-templaatin RAA-valinta tuotti suuren määrän amplikoneja. Tämä lisäsi merkittävästi määrityksen herkkyyttä. Toisessa vaiheessa Cas12a:n trans-katkaisuaktiivisuus aktivoitiin, mikä johti lukuisten ssDNA-reportterien pilkkoutumiseen. Viimeinen vaihe johti kahteen eri signaalin ulostulomoodiin: FQ-reportterifluoresenssimääritys ja lateraalivirtausliuska, jotka paransivat RAA-Cas12a-MPXV-määrityksen käytettävyyttä ja sopivuutta.

Fluoresenssituloksia DNA-templaattien ja RAA-tuotteen kanssa tai ilman niitä verrattiin määrityksen toteutettavuuden arvioimiseksi. Ryhmä ilman DNA:ta oli kontrolli, joka ei osoittanut merkittävää fluoresenssimuutosta. Tämä osoitti, että DNA-templaattien puuttuessa ei muodostunut yhtään RAA-amplikonia, jonka myöhempi CRISPR/Cas12a voisi tunnistaa.

Suuremman selektiivisyyden ja herkkyyden varmistamiseksi suunniteltiin kolme alukeparia, jotka sitoutuivat MPXV-spesifisen F3L-geenin eri kohtiin. Optimaalisten alukkeiden löytämiseksi tulevia kokeita varten suoritettiin RAA-Cas12a-MPXV-fluoresenssimääritys ja agaroosigeelielektroforeesi (AGE). Kolmas pari (F2+R2) saavutti kirkkaimman ominaisvahvistuskaistan.

Monet tärkeät kokeelliset olosuhteet, jotka liittyvät CRISPR/Cas12a-järjestelmään ja RAA-Cas12a-MPXV-määritykseen, optimoitiin, ja RAA:n lämpötila ja reaktioaika olivat ensisijainen painopiste. Seuraavaksi CRISPR/Cas12a-järjestelmä optimoitiin crRNA2:lla.

RAA-Cas12a-MPXV-fluoresenssimääritystä pidettiin helppokäyttöisenä ja sopivana pikatestaukseen. Verrattuna PCR-Cas12a-MPXV-fluoresenssimääritykseen, RAA-Cas12a-MPXV-fluoresenssimääritys osoitti erinomaista herkkyyttä 1000-kertaisella havaitsemisrajalla (LOD).

RAA-Cas12a-MPXV-fluoresenssimäärityksen selektiivisyys määritettiin vertaamalla MPXV:n tuottaman fluoresenssin tasoa muihin viruksiin, kuten variolavirukseen (VARV), lehmärokkovirukseen (CPXV) ja vakavaan akuuttiin hengitystieoireyhtymään koronavirus-2:een (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii -virus (TOXV) ja afrikkalainen sikaruttovirus (ASFV). Sekä paljain silmin havainnointi että fluoresenssiarvot osoittivat, että vain MPXV indusoi tehostettua fluoresenssia, kun taas muut virukset eivät.

FAM-biotiinireportteri (FB-reportteri) kehitettiin korvaamaan fluoresenssimäärityksen FQ-reportteri ja sen jälkeen perustettiin RAA-Cas12a-MPXV lateraalivirtausliuskamääritys POCT:lle. Reaktioliuoksen lisääminen, joka sisälsi ehjät FB-reportterit, hajotti FAM:t ja biotiinia näytetyynyissä ja aiheutti anti-FAM-vasta-aine/AuNP-kompleksien nopean sitoutumisen eristettyihin FAM:eihin ja FB-reportteriin näytteen siirtyessä eteenpäin. Lopuksi kontrollivyöhykkeelle immobilisoitu streptavidiini sieppasi pilkotut biotiinit ja FB-reportteri/anti-FAM-vasta-aine/AuNP-kompleksit.

Aluksi kontrollivyöhyke näytti punaiselta AuNP:iden aggregoitumisen vuoksi. Sen jälkeen loput eristetyistä FAM/anti-FAM-vasta-aine/AuNP-komplekseista siirtyivät testivyöhykkeelle ja reagoivat punaisilta näyttävien FAM-vasta-aineiden kanssa. Lopuksi amplikonit aktivoivat Cas12a:n katkaisemaan kaikki FB-toimittajat. Värinmuutos säilyi vain testinauhalla.

Lyhyesti sanottuna, jos värinmuutos havaittiin vain testivyöhykkeellä tai sekä kontrolli- että testivyöhykkeillä, sitä pidettiin positiivisena tuloksena. Toisaalta, jos värin muutos havaittiin vain kontrollivyöhykkeellä, tämä osoitti negatiivista tulosta, ts. h. DNA-templaattien puute ei johtanut amplikoneihin Cas12a-aktivaatiolle.

Johtopäätökset

RAA-Cas12a-MPXV-määrityksen keskeinen etu on, että se voidaan suorittaa miedossa lämpötilassa perinteisiin menetelmiin verrattuna. Tärkeää on, että tämä määritys oli tehokas MPXV-diagnostiikkamenetelmä, jolla oli erinomainen selektiivisyys, herkkyys ja siirrettävyys.

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Viitteet:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Artikkelin tarkistukset

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.