Suche
Mein Konto
Tests sur site pour les virus de la variole du singe hautement sensibles à l'aide de CRISPR/Cas12a
Le virus Monkeypox (MPXV), isolé pour la première fois en 1958, est un virus à ADN double brin (ADNdb). Lorsque le premier cas humain a été détecté en République démocratique du Congo en 1970, la maladie a été reconnue comme zoonotique. Le MPXV suscite actuellement une inquiétude mondiale en raison de sa transmission généralisée depuis l’Afrique centrale et occidentale. Pour contenir la propagation de ce virus, une détection rapide, hautement sensible et spécifique est essentielle. Dans une nouvelle étude publiée sur le serveur de prépublication medRxiv* : Des chercheurs en Chine ont développé pour la première fois un test MPXV qui combine de courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées, une protéine associée à CRISPR (CRISPR/Cas) et une amplification assistée par la recombinase (RAA). Le …
Tests sur site pour les virus de la variole du singe hautement sensibles à l'aide de CRISPR/Cas12a
Le virus Monkeypox (MPXV), isolé pour la première fois en 1958, est un virus à ADN double brin (ADNdb). Lorsque le premier cas humain a été détecté en République démocratique du Congo en 1970, la maladie a été reconnue comme zoonotique. Le MPXV suscite actuellement une inquiétude mondiale en raison de sa transmission généralisée depuis l’Afrique centrale et occidentale.
Pour contenir la propagation de ce virus, une détection rapide, hautement sensible et spécifique est essentielle. Dans une nouvelle étude publiée dans le medRxiv * Serveur de prépublication : des chercheurs chinois ont développé pour la première fois un test MPXV qui combine de courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées, une protéine associée à CRISPR (CRISPR/Cas) et une amplification assistée par la recombinase (RAA). Le test a montré une sélectivité élevée et a permis de distinguer le MPXV des autres orthopoxvirus.
Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Des liens vers les rapports préliminaires et évalués par des pairs se trouvent dans la section Sources à la fin de cet article. Afficher les sources
arrière-plan
Actuellement, les tests MPXV utilisent des méthodes telles que le test immunoenzymatique (ELISA), la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et l'amplification isotherme à médiation en boucle (LAMP). La PCR est la référence en matière de précision et de sensibilité, mais elle est difficile à utiliser dans les zones pauvres en ressources. L'ELISA pourrait donner des résultats faussement positifs lors d'une vaccination récente ou lointaine, et les inconvénients du LAMP sont liés à une conception d'amorce compliquée, à de mauvaises performances quantitatives, etc. Il manque actuellement des méthodes rapides, ultra-sensibles et rentables qui facilitent la détection sur place et facile du MPXV.
À propos de l'étude
CRISPR/Cas a été découvert pour la première fois dans le système immunitaire adaptatif des procaryotes. Le système CRISPR/Cas12a intègre la transduction du signal et la biodétection a été utilisée pour détecter plusieurs virus, dont le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Il offre de nombreux avantages liés à des conditions douces, une sensibilité élevée, une utilisation simple et une amplification puissante du signal.
À ce jour, aucun problème critique lié à l'utilisation de la technologie CRISPR dans la détection du MPXV n'a été signalé, tel que : B. Dépistage des sondes, performances analytiques, pré-amplification et tests au point d'intervention (POCT). Par conséquent, l’étude actuelle a proposé pour la première fois un test rapide et hautement sensible combinant l’amplification assistée par la recombinase (RAA) et CRISPR/Cas12a, c’est-à-dire le test RAA-Cas12a-MPXV. Le principe impliquait trois étapes : l’amplification RAA, le clivage CRISPR/Cas12a et la sortie du signal.
Résultats clés
Dans un premier temps, la sélection RAA de la matrice d’ADN a généré un grand nombre d’amplicons. Cela a considérablement augmenté la sensibilité du test. Dans la deuxième étape, l’activité de trans-clivage de Cas12a a été activée, conduisant au clivage de nombreux rapporteurs d’ADN simple brin. La dernière étape a abouti à deux modes de sortie de signal différents : le test de fluorescence du rapporteur FQ et la bandelette à flux latéral, ce qui a amélioré la convivialité et l'adéquation du test RAA-Cas12a-MPXV.
Les résultats de fluorescence avec ou sans matrices d'ADN et le produit RAA ont été comparés pour évaluer la faisabilité du test. Le groupe sans ADN était le contrôle, qui ne présentait aucun changement significatif de fluorescence. Cela indique qu’en l’absence de matrices d’ADN, aucun amplicon RAA n’a été généré et pourrait être reconnu par CRISPR/Cas12a ultérieur.
Pour garantir une sélectivité et une sensibilité plus élevées, trois paires d'amorces ont été conçues, liées à différents sites du gène F3L spécifique du MPXV. Pour trouver les amorces optimales pour les expériences futures, un test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV et une électrophorèse sur gel d'agarose (AGE) ont été réalisés. La troisième paire (F2+R2) a atteint la bande de gain spécifique la plus brillante.
De nombreuses conditions expérimentales importantes liées au système CRISPR/Cas12a et au test RAA-Cas12a-MPXV ont été optimisées, la température et le temps de réaction du RAA étant l'objectif principal. Ensuite, le système CRISPR/Cas12a a été optimisé avec crRNA2.
Le test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a été considéré comme facile à utiliser et adapté aux tests rapides. Comparé au test de fluorescence PCR-Cas12a-MPXV, le test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a démontré une excellente sensibilité avec une limite inférieure de détection (LOD) 1 000 fois.
La sélectivité du test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a été déterminée en comparant le niveau de fluorescence produit par MPXV avec d'autres virus tels que le virus variolique (VARV), le virus cowpox (CPXV) et le coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-). CoV-2), le virus Toxoplasma Gondii (TOXV) et le virus de la peste porcine africaine (ASFV). L’observation à l’œil nu et les valeurs de fluorescence ont montré que seul le MPXV induisait une fluorescence accrue, contrairement aux autres virus.
Le rapporteur FAM-biotine (rapporteur FB) a été développé en remplacement du rapporteur FQ du test de fluorescence, puis le test par bandelette à flux latéral RAA-Cas12a-MPXV pour POCT a été créé. L'ajout d'une solution réactionnelle contenant des rapporteurs FB intacts a perturbé les FAM et la biotine dans les tampons d'échantillon et provoqué une liaison rapide des complexes anticorps anti-FAM/AuNP avec des FAM et des rapporteurs FB isolés à mesure que l'échantillon migrait vers l'avant. Enfin, la streptavidine immobilisée sur la bande témoin a capturé les biotines clivées et les complexes rapporteur FB/anticorps anti-FAM/AuNP.
Initialement, la bande de contrôle apparaissait en rouge en raison de l’agrégation des AuNP. Par la suite, le reste des complexes FAM/anticorps anti-FAM/AuNP isolés ont migré vers la bande de test et ont réagi avec les anticorps FAM apparaissant en rouge. Enfin, les amplicons ont activé Cas12a pour cliver tous les rapporteurs FB. Le changement de couleur n'a persisté que sur la bande de test.
En bref, si le changement de couleur était observé uniquement dans la bande de test ou dans les bandes de contrôle et de test, il était considéré comme un résultat positif. En revanche, si le changement de couleur n'était observé que sur la bande témoin, cela indiquait un résultat négatif, c'est-à-dire h. le manque de matrices d'ADN n'a entraîné aucun amplicons pour l'activation de Cas12a.
Conclusions
L’un des principaux avantages du test RAA-Cas12a-MPXV est qu’il peut être réalisé à une température douce par rapport aux méthodes traditionnelles. Il est important de noter que ce test constitue une méthode de diagnostic MPXV puissante, dotée d’une sélectivité, d’une sensibilité et d’une portabilité supérieures.
Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Des liens vers les rapports préliminaires et évalués par des pairs se trouvent dans la section Sources à la fin de cet article. Afficher les sources
Références :
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.
Révisions d'articles
- 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.