Testiranje na licu mjesta za vrlo osjetljive viruse majmunskih boginja pomoću CRISPR/Cas12a

Testiranje na licu mjesta za vrlo osjetljive viruse majmunskih boginja pomoću CRISPR/Cas12a

Virus majmunskih boginja (MPXV), prvi put izoliran 1958., dvolančani je DNA (dsDNA) virus. Kada je prvi slučaj kod ljudi otkriven u Demokratskoj Republici Kongo 1970. godine, bolest je prepoznata kao zoonotska bolest. Trenutno postoji globalna zabrinutost oko MPXV-a zbog široko rasprostranjenog prijenosa iz središnje i zapadne Afrike.

Za suzbijanje širenja ovog virusa neophodna je brza, vrlo osjetljiva i specifična detekcija. U novoj studiji objavljenoj u medRxiv * Preprint poslužitelj: istraživači u Kini su po prvi put razvili MPXV test koji kombinira klasterirana, pravilno raspoređena kratka palindromska ponavljanja i protein povezan s CRISPR-om (CRISPR/Cas) i pojačanje potpomognuto rekombinazom (RAA). Test je pokazao visoku selektivnost i mogao je razlikovati MPXV od drugih ortopoksvirusa.

Studija: Visokoosjetljivo testiranje virusa majmunskih boginja na licu mjesta posredovano CRISPR/Cas12a. Izvor slike: Dotted Yeti / Shutterstock

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

pozadina

Trenutno MPXV testiranje koristi metode kao što su enzimski imunotest (ELISA), lančana reakcija polimerazom (PCR) i izotermno pojačanje posredovano petljom (LAMP). PCR je zlatni standard i točan je i osjetljiv, ali ga je teško koristiti u područjima sa siromašnim resursima. ELISA bi mogla dati lažno pozitivne rezultate u nedavnom ili daljnjem cijepljenju, a nedostaci LAMP-a povezani su s kompliciranim dizajnom početnih cjepiva, lošom kvantitativnom izvedbom itd. Trenutno nedostaju brze, ultraosjetljive i isplative metode koje olakšavaju jednostavno otkrivanje MPXV-a na licu mjesta.

O studiju

CRISPR/Cas je prvi put otkriven u adaptivnom imunološkom sustavu prokariota. Sustav CRISPR/Cas12a integrira prijenos signala i biodetekcija se koristi za otkrivanje nekoliko virusa, uključujući teški akutni respiratorni sindrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Nudi mnoge prednosti vezane uz blage uvjete, visoku osjetljivost, jednostavno rukovanje i snažno pojačanje signala.

Do danas nisu prijavljeni nikakvi kritični problemi u vezi s upotrebom CRISPR tehnologije u detekciji MPXV, kao što su: B. Probir sonde, analitička izvedba, prethodno pojačanje i testiranje na mjestu skrbi (POCT). Stoga je trenutna studija po prvi put predložila brzi i vrlo osjetljivi test koji kombinira pojačanje potpomognuto rekombinazom (RAA) i CRISPR/Cas12a, tj. RAA-Cas12a-MPXV test. Princip je uključivao tri koraka: pojačanje RAA, cijepanje CRISPR/Cas12a i izlaz signala.

Ključni rezultati

U prvom koraku, RAA selekcija uzorka DNK generirala je velik broj amplikona. Ovo je značajno povećalo osjetljivost testa. U drugom koraku aktivirana je aktivnost trans-cijepanja Cas12a, što je dovelo do cijepanja brojnih ssDNA reportera. Posljednji korak rezultirao je s dva različita načina izlaza signala: FQ reporter fluorescencijski test i lateral flow strip, što je poboljšalo upotrebljivost i prikladnost RAA-Cas12a-MPXV testa.

Rezultati fluorescencije sa ili bez DNA šablona i RAA produkta uspoređeni su kako bi se procijenila izvedivost testa. Skupina bez DNK bila je kontrola, koja nije pokazala značajnu promjenu fluorescencije. Ovo je pokazalo da u nedostatku DNK šablona nije generiran nijedan RAA amplikon koji bi mogao biti prepoznat naknadnim CRISPR/Cas12a.

Kako bi se osigurala veća selektivnost i osjetljivost, dizajnirana su tri para primera koji su se vezali na različita mjesta MPXV-specifičnog F3L gena. Kako bi se pronašli optimalni primeri za buduće pokuse, provedena je analiza fluorescencije RAA-Cas12a-MPXV i elektroforeza u agaroznom gelu (AGE). Treći par (F2+R2) dosegao je najsvjetliji specifični pojačani pojas.

Optimizirani su mnogi važni eksperimentalni uvjeti povezani sa sustavom CRISPR/Cas12a i RAA-Cas12a-MPXV testom, pri čemu su temperatura i vrijeme reakcije RAA bili primarni fokus. Zatim je sustav CRISPR/Cas12a optimiziran s crRNA2.

RAA-Cas12a-MPXV test fluorescencije smatra se jednostavnim za korištenje i prikladnim za brzo testiranje. U usporedbi s PCR-Cas12a-MPXV testom fluorescencije, RAA-Cas12a-MPXV test fluorescencije pokazao je izvrsnu osjetljivost s 1000 puta nižom granicom detekcije (LOD).

Selektivnost testa fluorescencije RAA-Cas12a-MPXV određena je usporedbom razine fluorescencije koju proizvodi MPXV s drugim virusima kao što su virus variole (VARV), virus kravljih boginja (CPXV) i koronavirus-2 teškog akutnog respiratornog sindroma (SARS-). CoV-2), virus Toxoplasma Gondii (TOXV) i virus afričke svinjske kuge (ASFV). I promatranje golim okom i vrijednosti fluorescencije pokazali su da je samo MPXV inducirao pojačanu fluorescenciju, dok drugi virusi nisu.

FAM-biotinski reporter (FB reporter) razvijen je kao zamjena za FQ reporter testa fluorescencije, a nakon toga je uspostavljen RAA-Cas12a-MPXV test trake s bočnim protokom za POCT. Dodavanje reakcijske otopine koja sadrži intaktne FB reportere poremetilo je FAMs i biotin u jastučićima uzorka i izazvalo brzo vezanje kompleksa anti-FAM protutijela/AuNP s izoliranim FAMs i FB reporterima kako je uzorak migrirao naprijed. Konačno, streptavidin imobiliziran na kontrolnoj vrpci uhvatio je cijepane biotine i komplekse FB reporter/anti-FAM antitijelo/AuNP.

U početku se kontrolna vrpca činila crvenom zbog agregacije AuNP-ova. Nakon toga, ostatak izoliranih FAM/anti-FAM antitijela/AuNP kompleksa migrirao je na testnu traku i reagirao s FAM antitijelima koja su se pojavljivala crveno. Konačno, amplikoni su aktivirali Cas12a da cijepa sve FB novinare. Promjena boje ostala je samo na testnoj traci.

Ukratko, ako je promjena boje uočena samo na testnoj traci ili i na kontrolnoj i na testnoj traci, to se smatralo pozitivnim rezultatom. S druge strane, ako je promjena boje primijećena samo na kontrolnoj traci, to ukazuje na negativan rezultat, tj. h. nedostatak DNA šablona rezultirao je nedostatkom amplikona za aktivaciju Cas12a.

Zaključci

Ključna prednost RAA-Cas12a-MPXV testa je da se može izvesti na blagoj temperaturi u usporedbi s tradicionalnim metodama. Važno je da je ovaj test bio moćna MPXV dijagnostička metoda s vrhunskom selektivnošću, osjetljivošću i prenosivošću.

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Revizije članaka

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.