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Test in loco per virus del vaiolo delle scimmie altamente sensibili utilizzando CRISPR/Cas12a
Il virus del vaiolo delle scimmie (MPXV), isolato per la prima volta nel 1958, è un virus a DNA a doppio filamento (dsDNA). Quando nel 1970 fu individuato il primo caso umano nella Repubblica Democratica del Congo, la malattia fu riconosciuta come una malattia zoonotica. Attualmente esiste una preoccupazione globale per l’MPXV a causa della diffusa trasmissione dall’Africa centrale e occidentale. Per contenere la diffusione di questo virus è essenziale un rilevamento rapido, altamente sensibile e specifico. In un nuovo studio pubblicato sul server di pubblicazione preliminare medRxiv*: i ricercatori in Cina hanno sviluppato per la prima volta un test MPXV che combina brevi ripetizioni palindromiche raggruppate e regolarmente spaziate e proteina associata a CRISPR (CRISPR/Cas) e amplificazione assistita da ricombinasi (RAA). IL …
Test in loco per virus del vaiolo delle scimmie altamente sensibili utilizzando CRISPR/Cas12a
Il virus del vaiolo delle scimmie (MPXV), isolato per la prima volta nel 1958, è un virus a DNA a doppio filamento (dsDNA). Quando nel 1970 fu individuato il primo caso umano nella Repubblica Democratica del Congo, la malattia fu riconosciuta come una malattia zoonotica. Attualmente esiste una preoccupazione globale per l’MPXV a causa della diffusa trasmissione dall’Africa centrale e occidentale.
Per contenere la diffusione di questo virus è essenziale un rilevamento rapido, altamente sensibile e specifico. In un nuovo studio pubblicato su medRxiv * Server di prestampa: ricercatori in Cina hanno sviluppato per la prima volta un test MPXV che combina brevi ripetizioni palindromiche raggruppate e spaziate regolarmente e la proteina associata a CRISPR (CRISPR/Cas) e l'amplificazione assistita da ricombinasi (RAA). Il test ha mostrato un'elevata selettività e ha potuto distinguere tra MPXV e altri orthopoxvirus.
Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti
sfondo
Attualmente, il test MPXV utilizza metodi come il dosaggio immunoenzimatico (ELISA), la reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). La PCR è il gold standard ed è accurata e sensibile, ma difficile da utilizzare in aree povere di risorse. L’ELISA potrebbe dare risultati falsi positivi in vaccinazioni recenti o a distanza e gli svantaggi di LAMP sono legati alla complicata progettazione dei primer, alle scarse prestazioni quantitative, ecc. Attualmente mancano metodi veloci, ultrasensibili ed economici che facilitino il rilevamento in loco e facile di MPXV.
A proposito dello studio
CRISPR/Cas è stato scoperto per la prima volta nel sistema immunitario adattativo dei procarioti. Il sistema CRISPR/Cas12a integra la trasduzione del segnale e il biorilevamento è stato utilizzato per rilevare diversi virus, inclusa la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Offre molti vantaggi legati a condizioni miti, alta sensibilità, facilità d'uso e potente amplificazione del segnale.
Ad oggi non sono stati segnalati problemi critici legati all'uso della tecnologia CRISPR nel rilevamento di MPXV, come ad esempio: B. Screening della sonda, prestazioni analitiche, preamplificazione e test al punto di cura (POCT). Pertanto, il presente studio ha proposto per la prima volta un test rapido e altamente sensibile che combina l’amplificazione assistita da ricombinasi (RAA) e CRISPR/Cas12a, ovvero il test RAA-Cas12a-MPXV. Il principio prevedeva tre fasi: amplificazione RAA, scissione CRISPR/Cas12a e uscita del segnale.
Risultati chiave
Nella prima fase, la selezione RAA del modello di DNA ha generato un gran numero di ampliconi. Ciò ha aumentato significativamente la sensibilità del test. Nella seconda fase, è stata attivata l'attività di trans-scissione di Cas12a, portando alla scissione di numerosi reporter di ssDNA. La fase finale ha prodotto due diverse modalità di uscita del segnale: test di fluorescenza reporter FQ e striscia di flusso laterale, che hanno migliorato l'usabilità e l'idoneità del test RAA-Cas12a-MPXV.
I risultati della fluorescenza con o senza modelli di DNA e il prodotto RAA sono stati confrontati per valutare la fattibilità del test. Il gruppo senza DNA era il controllo, che non mostrava alcun cambiamento significativo nella fluorescenza. Ciò indicava che in assenza di modelli di DNA, non veniva generato alcun amplicone RAA che potesse essere riconosciuto dal successivo CRISPR/Cas12a.
Per garantire selettività e sensibilità più elevate, sono state progettate tre coppie di primer che si legavano a siti diversi del gene F3L specifico di MPXV. Per trovare i primer ottimali per esperimenti futuri, sono stati eseguiti il test di fluorescenza RAA-Cas12a-MPXV e l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE). La terza coppia (F2+R2) ha raggiunto la banda di guadagno specifico più brillante.
Molte importanti condizioni sperimentali relative al sistema CRISPR/Cas12a e al test RAA-Cas12a-MPXV sono state ottimizzate, concentrandosi principalmente sulla temperatura e sul tempo di reazione del RAA. Successivamente, il sistema CRISPR/Cas12a è stato ottimizzato con crRNA2.
Il test di fluorescenza RAA-Cas12a-MPXV è stato considerato facile da usare e adatto per test rapidi. Rispetto al test di fluorescenza PCR-Cas12a-MPXV, il test di fluorescenza RAA-Cas12a-MPXV ha dimostrato un'eccellente sensibilità con un limite di rilevamento (LOD) inferiore di 1000 volte.
La selettività del test di fluorescenza RAA-Cas12a-MPXV è stata determinata confrontando il livello di fluorescenza prodotto da MPXV con altri virus come il virus variola (VARV), il virus del vaiolo bovino (CPXV) e la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2 (SARS-). CoV-2), il virus Toxoplasma Gondii (TOXV) e il virus della peste suina africana (ASFV). Sia l’osservazione a occhio nudo che i valori di fluorescenza hanno mostrato che solo MPXV induceva una maggiore fluorescenza, mentre altri virus no.
Il reporter FAM-biotina (reporter FB) è stato sviluppato in sostituzione del reporter FQ del test di fluorescenza e successivamente è stato istituito il test su strip a flusso laterale RAA-Cas12a-MPXV per POCT. L'aggiunta di una soluzione di reazione contenente reporter FB intatti ha interrotto i FAM e la biotina nei tamponi campione e ha causato un rapido legame dei complessi anticorpo anti-FAM/AuNP con FAM isolati e reporter FB mentre il campione migrava in avanti. Infine, la streptavidina immobilizzata sulla banda di controllo ha catturato le biotine scisse e i complessi reporter FB/anticorpo anti-FAM/AuNP.
Inizialmente, la banda di controllo appariva rossa a causa dell'aggregazione degli AuNP. Successivamente, il resto dei complessi FAM/anticorpo anti-FAM/AuNP isolati sono migrati nella banda del test e hanno reagito con gli anticorpi FAM che apparivano rossi. Infine, gli ampliconi hanno attivato Cas12a per scindere tutti i reporter di FB. Il cambiamento di colore persisteva solo sul nastro di prova.
In breve, se il cambiamento di colore è stato osservato solo nella banda del test o sia nella banda di controllo che in quella del test, è stato considerato un risultato positivo. D'altra parte, se il cambiamento di colore veniva osservato solo sulla banda di controllo, ciò indicava un risultato negativo, cioè h. la mancanza di modelli di DNA non ha prodotto ampliconi per l'attivazione di Cas12a.
Conclusioni
Un vantaggio fondamentale del test RAA-Cas12a-MPXV è che può essere eseguito a una temperatura mite rispetto ai metodi tradizionali. È importante sottolineare che questo test era un potente metodo diagnostico MPXV con selettività, sensibilità e portabilità superiori.
Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti
Riferimenti:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.
Revisioni degli articoli
- 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.