Labai jautrių beždžionių raupų virusų tyrimas vietoje naudojant CRISPR/Cas12a

Labai jautrių beždžionių raupų virusų tyrimas vietoje naudojant CRISPR/Cas12a

Beždžionių raupų virusas (MPXV), pirmą kartą išskirtas 1958 m., yra dvigrandė DNR (dsDNR) virusas. Kai 1970 m. Kongo Demokratinėje Respublikoje buvo aptiktas pirmasis žmogaus atvejis, ši liga buvo pripažinta zoonozine liga. Šiuo metu visame pasaulyje kyla susirūpinimas dėl MPXV dėl plačiai paplitusio perdavimo iš Centrinės ir Vakarų Afrikos.

Norint sustabdyti šio viruso plitimą, būtina greitai, labai jautriai ir konkrečiai nustatyti. Naujame tyrime, paskelbtame medRxiv * Išankstinio spausdinimo serveris: Kinijos mokslininkai pirmą kartą sukūrė MPXV tyrimą, kuris sujungia sugrupuotus, reguliariai išdėstytus trumpus palindrominius pasikartojimus ir su CRISPR susijusį baltymą (CRISPR/Cas) ir rekombinazės palaikomą amplifikaciją (RAA). Tyrimas parodė didelį selektyvumą ir galėjo atskirti MPXV ir kitus ortopokso virusus.

Tyrimas: CRISPR/Cas12a sukeltas didelio jautrumo beždžionių raupų viruso tyrimas vietoje. Vaizdo šaltinis: Dotted Yeti / Shutterstock

Šis naujienų straipsnis buvo išankstinės mokslinės ataskaitos, kuri publikavimo metu nebuvo recenzuota, apžvalga. Nuo pat pirminio paskelbimo mokslinė ataskaita buvo recenzuojama ir priimta publikuoti akademiniame žurnale. Nuorodos į preliminarias ir recenzuotas ataskaitas rasite skiltyje Šaltiniai šio straipsnio pabaigoje. Žiūrėti šaltinius

fone

Šiuo metu MPXV testavimui naudojami tokie metodai kaip fermentų imunologinis tyrimas (ELISA), polimerazės grandininė reakcija (PCR) ir kilpos tarpininkaujama izoterminė amplifikacija (LAMP). PGR yra aukso standartas, tikslus ir jautrus, tačiau jį sunku naudoti vietovėse, kuriose trūksta išteklių. ELISA gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus neseniai ar tolimoje vakcinacijoje, o LAMP trūkumai yra susiję su sudėtingu pradmenų dizainu, prastu kiekybiniu veikimu ir kt. Šiuo metu trūksta greitų, itin jautrių ir ekonomiškų metodų, palengvinančių MPXV aptikimą vietoje ir lengvą.

Apie studiją

CRISPR / Cas pirmą kartą buvo aptiktas prokariotų adaptyvioje imuninėje sistemoje. CRISPR/Cas12a sistema integruoja signalo perdavimą, o biologinis aptikimas buvo naudojamas aptikti kelis virusus, įskaitant sunkų ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusą 2 (SARS-CoV-2). Jis siūlo daug pranašumų, susijusių su švelniomis sąlygomis, dideliu jautrumu, lengvu valdymu ir galingu signalo stiprinimu.

Iki šiol nebuvo pranešta apie svarbias problemas, susijusias su CRISPR technologijos naudojimu MPXV aptikimui, pvz.: B. Zodo patikra, analizės našumas, išankstinis amplifikacijos ir priežiūros taškas (POCT). Todėl dabartinis tyrimas pirmą kartą pasiūlė greitą ir labai jautrų tyrimą, kuris apjungia rekombinazės sukeltą amplifikaciją (RAA) ir CRISPR / Cas12a, ty RAA-Cas12a-MPXV tyrimą. Principas apėmė tris etapus: RAA stiprinimą, CRISPR/Cas12a skilimą ir signalo išvestį.

Pagrindiniai rezultatai

Pirmajame etape DNR šablono RAA parinkimas sukūrė daug amplikonų. Tai žymiai padidino tyrimo jautrumą. Antrame etape buvo suaktyvintas Cas12a trans-skilimo aktyvumas, dėl kurio buvo suskaidyti daugybė ssDNR reporterių. Paskutiniame etape buvo sukurti du skirtingi signalo išvesties režimai: FQ reporterio fluorescencinis tyrimas ir šoninio srauto juosta, kuri pagerino RAA-Cas12a-MPXV tyrimo tinkamumą naudoti ir tinkamumą.

Fluorescencijos rezultatai su arba be DNR šablonų ir RAA produkto buvo lyginami, siekiant įvertinti tyrimo pagrįstumą. Grupė be DNR buvo kontrolė, kuri neparodė reikšmingų fluorescencijos pokyčių. Tai parodė, kad nesant DNR šablonų, nebuvo sukurtas joks RAA amplikonas, kurį galėtų atpažinti vėlesnis CRISPR / Cas12a.

Siekiant užtikrinti didesnį selektyvumą ir jautrumą, buvo sukurtos trys pradmenų poros, kurios prisijungė prie skirtingų MPXV specifinio F3L geno vietų. Norint rasti optimalius pradmenis būsimiems eksperimentams, buvo atliktas RAA-Cas12a-MPXV fluorescencinis tyrimas ir agarozės gelio elektroforezė (AGE). Trečioji pora (F2+R2) pasiekė ryškiausią specifinio stiprinimo juostą.

Daug svarbių eksperimentinių sąlygų, susijusių su CRISPR / Cas12a sistema ir RAA-Cas12a-MPXV tyrimu, buvo optimizuotos, o pagrindinis dėmesys buvo skiriamas RAA temperatūrai ir reakcijos laikui. Tada CRISPR / Cas12a sistema buvo optimizuota naudojant crRNA2.

Buvo manoma, kad RAA-Cas12a-MPXV fluorescencinis tyrimas yra paprastas naudoti ir tinkamas greitam testavimui. Palyginti su PCR-Cas12a-MPXV fluorescenciniu tyrimu, RAA-Cas12a-MPXV fluorescencinis tyrimas parodė puikų jautrumą su 1000 kartų apatine aptikimo riba (LOD).

RAA-Cas12a-MPXV fluorescencinio tyrimo selektyvumas buvo nustatytas lyginant MPXV sukeltos fluorescencijos lygį su kitais virusais, tokiais kaip variola virusas (VARV), karvių raupų virusas (CPXV) ir sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas-2 (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii virusas (TOXV) ir afrikinio kiaulių maro virusas (ASFV). Tiek stebėjimas plika akimi, tiek fluorescencijos reikšmės parodė, kad tik MPXV sukėlė sustiprintą fluorescenciją, o kiti virusai ne.

FAM-biotino reporteris (FB reporteris) buvo sukurtas kaip fluorescencinio tyrimo FQ reporterio pakaitalas, o vėliau buvo sukurtas RAA-Cas12a-MPXV šoninio srauto juostos tyrimas POCT. Pridėjus reakcijos tirpalą, kuriame buvo nepažeisti FB reporteriai, mėginio pagalvėlėse buvo sutrikdytas FAM ir biotinas ir greitas anti-FAM antikūnų/AuNP kompleksų susiejimas su izoliuotais FAM ir FB reporteriais, mėginiui migruojant į priekį. Galiausiai, streptavidinas, imobilizuotas ant kontrolinės juostos, užfiksavo suskaldytus biotinus ir FB reporterio / anti-FAM antikūno / AuNP kompleksus.

Iš pradžių kontrolinė juosta pasirodė raudona dėl AuNP agregacijos. Vėliau likę izoliuoti FAM / anti-FAM antikūnų / AuNP kompleksai migravo į bandomąją juostą ir sureagavo su raudonais FAM antikūnais. Galiausiai amplikonai suaktyvino Cas12a, kad suskaidytų visus FB reporterius. Spalvos pasikeitimas išliko tik bandomojoje juostoje.

Trumpai tariant, jei spalvos pokytis buvo pastebėtas tik bandymo juostoje arba tiek kontrolinėje, tiek bandymo juostoje, tai buvo laikoma teigiamu rezultatu. Kita vertus, jei spalvos pokytis buvo pastebėtas tik kontrolinėje juostoje, tai rodė neigiamą rezultatą, ty h. DNR šablonų trūkumas nesukėlė Cas12a aktyvacijos amplikonų.

Išvados

Pagrindinis RAA-Cas12a-MPXV tyrimo pranašumas yra tas, kad jį galima atlikti esant švelniai temperatūrai, palyginti su tradiciniais metodais. Svarbu tai, kad šis tyrimas buvo galingas MPXV diagnostikos metodas, pasižymintis puikiu selektyvumu, jautrumu ir perkeliamumu.

Šis naujienų straipsnis buvo išankstinės mokslinės ataskaitos, kuri publikavimo metu nebuvo recenzuota, apžvalga. Nuo pat pirminio paskelbimo mokslinė ataskaita buvo recenzuojama ir priimta publikuoti akademiniame žurnale. Nuorodos į preliminarias ir recenzuotas ataskaitas rasite skiltyje Šaltiniai šio straipsnio pabaigoje. Žiūrėti šaltinius

Nuorodos:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Straipsnių pataisymai

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.