Ļoti jutīgu pērtiķu baku vīrusu pārbaude uz vietas, izmantojot CRISPR/Cas12a

Ļoti jutīgu pērtiķu baku vīrusu pārbaude uz vietas, izmantojot CRISPR/Cas12a

Pērtiķu baku vīruss (MPXV), kas pirmo reizi tika izolēts 1958. gadā, ir divpavedienu DNS (dsDNS) vīruss. Kad 1970. gadā Kongo Demokrātiskajā Republikā tika atklāts pirmais cilvēka saslimšanas gadījums, slimība tika atzīta par zoonozi. Pašlaik globālās bažas par MPXV ir plaši izplatītas pārraides no Centrālās un Rietumāfrikas.

Lai ierobežotu šī vīrusa izplatību, ir ļoti svarīgi ātri, ļoti jutīgi un specifiski atklāt. Jaunā pētījumā, kas publicēts medRxiv * Priekšdrukas serveris: Ķīnas pētnieki pirmo reizi ir izstrādājuši MPXV testu, kas apvieno grupētus, regulāri izvietotus īsus palindromiskus atkārtojumus un ar CRISPR saistītu proteīnu (CRISPR/Cas) un rekombināzes palīdzību (RAA). Tests uzrādīja augstu selektivitāti un varēja atšķirt MPXV un citus ortopoksvīrusus.

Pētījums: CRISPR/Cas12a mediēta augstas jutības mērkaķbaku vīrusa pārbaude uz vietas. Attēla avots: Dotted Yeti / Shutterstock

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

fons

Pašlaik MPXV testēšanā tiek izmantotas tādas metodes kā enzīmu imūntests (ELISA), polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) un cilpas mediētā izotermiskā amplifikācija (LAMP). PCR ir zelta standarts, un tas ir precīzs un jutīgs, bet grūti lietojams apgabalos, kuros trūkst resursu. ELISA var sniegt viltus pozitīvus rezultātus nesenā vai attālā vakcinācijā, un LAMP trūkumi ir saistīti ar sarežģītu praimeru dizainu, sliktu kvantitatīvo veiktspēju utt. Pašlaik trūkst ātras, īpaši jutīgas un rentablas metodes, kas atvieglo MPXV noteikšanu uz vietas un vieglu.

Par pētījumu

CRISPR/Cas pirmo reizi tika atklāts prokariotu adaptīvajā imūnsistēmā. CRISPR/Cas12a sistēma integrē signālu pārraidi, un bioloģiskā noteikšana ir izmantota, lai noteiktu vairākus vīrusus, tostarp smagu akūtu respiratorā sindroma koronavīrusu 2 (SARS-CoV-2). Tas piedāvā daudzas priekšrocības, kas saistītas ar viegliem apstākļiem, augstu jutību, vieglu darbību un jaudīgu signāla pastiprināšanu.

Līdz šim nav ziņots par kritiskām problēmām saistībā ar CRISPR tehnoloģijas izmantošanu MPXV noteikšanā, piemēram: B. Zondes skrīnings, analītiskā veiktspēja, pirmspastiprināšanas un aprūpes punkta pārbaude (POCT). Tāpēc pašreizējais pētījums pirmo reizi ierosināja ātru un ļoti jutīgu testu, kas apvieno rekombināzes atbalstīto amplifikāciju (RAA) un CRISPR / Cas12a, t.i., RAA-Cas12a-MPXV testu. Principā bija trīs soļi: RAA pastiprināšana, CRISPR/Cas12a šķelšanās un signāla izvade.

Galvenie rezultāti

Pirmajā posmā DNS veidnes RAA atlase radīja lielu skaitu amplikonu. Tas ievērojami palielināja testa jutību. Otrajā posmā tika aktivizēta Cas12a trans-šķelšanās aktivitāte, izraisot daudzu ssDNS reportieru šķelšanos. Pēdējā posmā tika izveidoti divi dažādi signāla izvades režīmi: FQ reportiera fluorescences tests un sānu plūsmas josla, kas uzlaboja RAA-Cas12a-MPXV testa lietojamību un piemērotību.

Lai novērtētu testa iespējamību, tika salīdzināti fluorescences rezultāti ar vai bez DNS veidnēm un RAA produktu. Grupa bez DNS bija kontrole, kas neuzrādīja būtiskas fluorescences izmaiņas. Tas norādīja, ka, ja nav DNS veidņu, netika ģenerēts neviens RAA amplikons, ko varētu atpazīt turpmākais CRISPR / Cas12a.

Lai nodrošinātu augstāku selektivitāti un jutību, tika izveidoti trīs primeru pāri, kas saistījās ar dažādām MPXV specifiskā F3L gēna vietām. Lai atrastu optimālos primerus turpmākajiem eksperimentiem, tika veikts RAA-Cas12a-MPXV fluorescences tests un agarozes gēla elektroforēze (AGE). Trešais pāris (F2+R2) sasniedza spilgtāko specifiskā pastiprinājuma joslu.

Tika optimizēti daudzi svarīgi eksperimentālie apstākļi, kas saistīti ar CRISPR / Cas12a sistēmu un RAA-Cas12a-MPXV testu, un galvenā uzmanība tika pievērsta RAA temperatūrai un reakcijas laikam. Pēc tam CRISPR / Cas12a sistēma tika optimizēta ar crRNA2.

RAA-Cas12a-MPXV fluorescences tests tika uzskatīts par viegli lietojamu un piemērotu ātrai pārbaudei. Salīdzinot ar PCR-Cas12a-MPXV fluorescences testu, RAA-Cas12a-MPXV fluorescences tests uzrādīja izcilu jutību ar 1000 reižu zemāku noteikšanas robežu (LOD).

RAA-Cas12a-MPXV fluorescences testa selektivitāte tika noteikta, salīdzinot MPXV radītās fluorescences līmeni ar citiem vīrusiem, piemēram, variola vīrusu (VARV), govju baku vīrusu (CPXV) un smagu akūtu respiratorā sindroma koronavīrusu-2 (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii vīruss (TOXV) un Āfrikas cūku mēra vīruss (ASFV). Gan ar neapbruņotu aci, gan fluorescences vērtības parādīja, ka tikai MPXV izraisīja pastiprinātu fluorescenci, bet citi vīrusi to nedarīja.

FAM-biotīna reportieris (FB reportieris) tika izstrādāts kā fluorescences testa FQ reportiera aizstājējs, un pēc tam tika izveidots RAA-Cas12a-MPXV sānu plūsmas sloksnes tests POCT. Reakcijas šķīduma, kas satur neskartus FB reportierus, pievienošana izjauca FAM un biotīnu paraugu paliktņos un izraisīja ātru anti-FAM antivielu/AuNP kompleksu saistīšanos ar izolētiem FAM un FB reportieriem, paraugam migrējot uz priekšu. Visbeidzot, uz kontroles joslas imobilizētais streptavidīns uztvēra šķeltos biotīnus un FB reportiera / anti-FAM antivielu / AuNP kompleksus.

Sākotnēji kontroles josla parādījās sarkanā krāsā AuNP agregācijas dēļ. Pēc tam pārējie izolētie FAM / anti-FAM antivielu / AuNP kompleksi migrēja uz testa joslu un reaģēja ar FAM antivielām, kas parādījās sarkanā krāsā. Visbeidzot, amplikoni aktivizēja Cas12a, lai šķeltu visus FB reportierus. Krāsas maiņa saglabājās tikai uz testa lentes.

Īsumā, ja krāsas izmaiņas tika novērotas tikai testa joslā vai gan kontroles, gan testa joslās, tas tika uzskatīts par pozitīvu rezultātu. No otras puses, ja krāsas izmaiņas tika novērotas tikai kontroles joslā, tas norādīja uz negatīvu rezultātu, t.i., h. DNS veidņu trūkums neizraisīja amplikonus Cas12a aktivācijai.

Secinājumi

Galvenā RAA-Cas12a-MPXV testa priekšrocība ir tā, ka to var veikt mērenā temperatūrā salīdzinājumā ar tradicionālajām metodēm. Svarīgi, ka šis tests bija spēcīga MPXV diagnostikas metode ar izcilu selektivitāti, jutīgumu un pārnesamību.

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

Atsauces:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Rakstu labojumi

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.