Suche
Mein Konto
Testen ter plaatse op zeer gevoelige apenpokkenvirussen met behulp van CRISPR/Cas12a
Monkeypox-virus (MPXV), voor het eerst geïsoleerd in 1958, is een dubbelstrengig DNA-virus (dsDNA). Toen in 1970 het eerste geval bij de mens werd ontdekt in de Democratische Republiek Congo, werd de ziekte erkend als een zoönotische ziekte. Er bestaat momenteel mondiale bezorgdheid over MPXV vanwege de wijdverbreide overdracht vanuit Centraal- en West-Afrika. Om de verspreiding van dit virus in te dammen is een snelle, zeer gevoelige en specifieke detectie essentieel. In een nieuwe studie gepubliceerd op de medRxiv* preprint-server: Onderzoekers in China hebben voor het eerst een MPXV-test ontwikkeld die geclusterde, op regelmatige afstanden geplaatste korte palindrome herhalingen en CRISPR-geassocieerd eiwit (CRISPR/Cas) en door recombinase ondersteunde amplificatie (RAA) combineert. De …
Testen ter plaatse op zeer gevoelige apenpokkenvirussen met behulp van CRISPR/Cas12a
Monkeypox-virus (MPXV), voor het eerst geïsoleerd in 1958, is een dubbelstrengig DNA-virus (dsDNA). Toen in 1970 het eerste geval bij de mens werd ontdekt in de Democratische Republiek Congo, werd de ziekte erkend als een zoönotische ziekte. Er bestaat momenteel mondiale bezorgdheid over MPXV vanwege de wijdverbreide overdracht vanuit Centraal- en West-Afrika.
Om de verspreiding van dit virus in te dammen is een snelle, zeer gevoelige en specifieke detectie essentieel. Uit een nieuwe studie gepubliceerd in de medRxiv * Preprint-server: Onderzoekers in China hebben voor het eerst een MPXV-test ontwikkeld die geclusterde, op regelmatige afstanden geplaatste korte palindrome herhalingen en CRISPR-geassocieerd eiwit (CRISPR/Cas) en recombinase-ondersteunde amplificatie (RAA) combineert. De test vertoonde een hoge selectiviteit en kon onderscheid maken tussen MPXV en andere orthopoxvirussen.
Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen
achtergrond
Momenteel maken MPXV-testen gebruik van methoden zoals enzymimmunoassay (ELISA), polymerasekettingreactie (PCR) en lusgemedieerde isothermische amplificatie (LAMP). PCR is de gouden standaard en is nauwkeurig en gevoelig, maar moeilijk te gebruiken in gebieden met weinig hulpbronnen. ELISA zou vals-positieve resultaten kunnen opleveren bij recente vaccinatie of vaccinatie op afstand, en de nadelen van LAMP houden verband met ingewikkeld primerontwerp, slechte kwantitatieve prestaties, enz. Snelle, ultragevoelige en kosteneffectieve methoden die de lokale en gemakkelijke detectie van MPXV mogelijk maken, ontbreken momenteel.
Over de studie
CRISPR/Cas werd voor het eerst ontdekt in het adaptieve immuunsysteem van prokaryoten. Het CRISPR/Cas12a-systeem integreert signaaltransductie en biodetectie is gebruikt om verschillende virussen te detecteren, waaronder het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Het biedt vele voordelen met betrekking tot milde omstandigheden, hoge gevoeligheid, eenvoudige bediening en krachtige signaalversterking.
Tot op heden zijn er geen kritieke problemen gemeld met betrekking tot het gebruik van CRISPR-technologie bij MPXV-detectie, zoals: B. Probe-screening, analytische prestaties, pre-amplificatie en point-of-care-testen (POCT). Daarom stelde de huidige studie voor het eerst een snelle en zeer gevoelige test voor die recombinase-geassisteerde amplificatie (RAA) en CRISPR/Cas12a combineert, d.w.z. de RAA-Cas12a-MPXV-test. Het principe bestond uit drie stappen: RAA-versterking, CRISPR/Cas12a-splitsing en signaaluitvoer.
Belangrijkste resultaten
In de eerste stap genereerde RAA-selectie van de DNA-matrijs een groot aantal amplicons. Dit verhoogde de gevoeligheid van de test aanzienlijk. In de tweede stap werd de trans-splitsingsactiviteit van Cas12a geactiveerd, wat leidde tot de splitsing van talrijke ssDNA-reporters. De laatste stap resulteerde in twee verschillende signaaluitvoermodi: FQ-reporterfluorescentietest en laterale flowstrip, waardoor de bruikbaarheid en geschiktheid van de RAA-Cas12a-MPXV-test werd verbeterd.
Fluorescentieresultaten met of zonder DNA-matrijzen en het RAA-product werden vergeleken om de haalbaarheid van de test te evalueren. De groep zonder DNA was de controle, die geen significante fluorescentieverandering vertoonde. Dit gaf aan dat er bij afwezigheid van DNA-templates geen RAA-amplicon werd gegenereerd dat kon worden herkend door daaropvolgende CRISPR/Cas12a.
Om een hogere selectiviteit en gevoeligheid te garanderen, werden drie primerparen ontworpen die aan verschillende plaatsen van het MPXV-specifieke F3L-gen bonden. Om de optimale primers voor toekomstige experimenten te vinden, werden RAA-Cas12a-MPXV-fluorescentietest en agarosegelelektroforese (AGE) uitgevoerd. Het derde paar (F2+R2) bereikte de helderste specifieke versterkingsband.
Veel belangrijke experimentele omstandigheden gerelateerd aan het CRISPR/Cas12a-systeem en de RAA-Cas12a-MPXV-test werden geoptimaliseerd, waarbij de temperatuur en reactietijd van RAA de primaire focus waren. Vervolgens werd het CRISPR/Cas12a-systeem geoptimaliseerd met crRNA2.
De RAA-Cas12a-MPXV-fluorescentietest werd als eenvoudig te gebruiken en geschikt voor snelle tests beschouwd. Vergeleken met de PCR-Cas12a-MPXV-fluorescentietest vertoonde de RAA-Cas12a-MPXV-fluorescentietest een uitstekende gevoeligheid met een 1000-voudige lagere detectielimiet (LOD).
De selectiviteit van de RAA-Cas12a-MPXV-fluorescentietest werd bepaald door het fluorescentieniveau geproduceerd door MPXV te vergelijken met andere virussen zoals variolavirus (VARV), koepokkenvirus (CPXV) en ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus-2 (SARS-). CoV-2), Toxoplasma Gondii-virus (TOXV) en Afrikaanse varkenspestvirus (ASFV). Zowel observatie met het blote oog als fluorescentiewaarden toonden aan dat alleen MPXV verhoogde fluorescentie induceerde, terwijl andere virussen dat niet deden.
De FAM-biotinereporter (FB-reporter) werd ontwikkeld als vervanging voor de FQ-reporter van de fluorescentietest en vervolgens werd de RAA-Cas12a-MPXV laterale flowstriptest voor POCT ontwikkeld. Toevoeging van een reactieoplossing die intacte FB-reporters bevatte, verstoorde FAM's en biotine in de monsterkussentjes en veroorzaakte een snelle binding van de anti-FAM-antilichaam/AuNP-complexen met geïsoleerde FAM's en FB-reporters terwijl het monster naar voren migreerde. Tenslotte ving streptavidine, geïmmobiliseerd op de controleband, gesplitste biotines en de FB-reporter/anti-FAM-antilichaam/AuNP-complexen op.
Aanvankelijk leek de controleband rood vanwege de aggregatie van AuNP's. Vervolgens migreerde de rest van de geïsoleerde FAM/anti-FAM-antilichaam/AuNP-complexen naar de testband en reageerde met FAM-antilichamen die rood leken. Ten slotte activeerden amplicons Cas12a om alle FB-reporters te splitsen. De kleurverandering bleef alleen op de testtape bestaan.
Kortom, als de kleurverandering alleen in de testband of in zowel de controleband als de testband werd waargenomen, werd dit als een positief resultaat beschouwd. Als de kleurverandering daarentegen alleen op de controleband werd waargenomen, duidde dit op een negatief resultaat, d.w.z. h. het ontbreken van DNA-sjablonen resulteerde in geen amplicons voor Cas12a-activering.
Conclusies
Een belangrijk voordeel van de RAA-Cas12a-MPXV-test is dat deze bij een milde temperatuur kan worden uitgevoerd in vergelijking met traditionele methoden. Belangrijk is dat deze test een krachtige MPXV-diagnostische methode was met superieure selectiviteit, gevoeligheid en draagbaarheid.
Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen
Referenties:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.
Artikelrevisies
- 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.