Testy na miejscu pod kątem bardzo wrażliwych wirusów ospy małpiej przy użyciu CRISPR/Cas12a

Testy na miejscu pod kątem bardzo wrażliwych wirusów ospy małpiej przy użyciu CRISPR/Cas12a

Wirus małpiej ospy (MPXV), wyizolowany po raz pierwszy w 1958 r., jest wirusem o dwuniciowym DNA (dsDNA). Kiedy w 1970 r. w Demokratycznej Republice Konga wykryto pierwszy przypadek choroby u ludzi, chorobę uznano za chorobę odzwierzęcą. Obecnie na całym świecie istnieją obawy dotyczące MPXV ze względu na powszechne przenoszenie wirusa z Afryki Środkowej i Zachodniej.

Aby powstrzymać rozprzestrzenianie się tego wirusa, niezbędne jest szybkie, bardzo czułe i specyficzne wykrywanie. W nowym badaniu opublikowanym w czasopiśmie „ medRxiv * Serwer preprintów: Naukowcy w Chinach po raz pierwszy opracowali test MPXV, który łączy w sobie skupione, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromowe oraz białko związane z CRISPR (CRISPR/Cas) i amplifikację wspomaganą rekombinazą (RAA). Test wykazał wysoką selektywność i pozwalał na rozróżnienie MPXV od innych ortopokswirusów.

Badanie: Testowanie na miejscu wirusa ospy małpiej o wysokiej czułości za pośrednictwem CRISPR/Cas12a. Źródło obrazu: Kropkowany Yeti / Shutterstock

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

tło

Obecnie w badaniu MPXV wykorzystuje się takie metody, jak test immunoenzymatyczny (ELISA), reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP). PCR to złoty standard, jest dokładny i czuły, ale trudny w użyciu na obszarach ubogich w zasoby. Test ELISA może dawać fałszywie dodatnie wyniki w przypadku niedawnych lub odległych szczepień, a wady LAMP są związane ze skomplikowanym projektem startera, słabą wydajnością ilościową itp. Obecnie brakuje szybkich, ultraczułych i opłacalnych metod, które ułatwiają wykrywanie MPXV na miejscu.

O badaniu

CRISPR/Cas po raz pierwszy odkryto w adaptacyjnym układzie odpornościowym prokariotów. System CRISPR/Cas12a integruje transdukcję sygnału i biodetekcję zastosowano do wykrycia kilku wirusów, w tym koronaawirusa 2 zespołu ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Oferuje wiele korzyści związanych z łagodnymi warunkami, wysoką czułością, łatwą obsługą i mocnym wzmocnieniem sygnału.

Do chwili obecnej nie zgłoszono żadnych krytycznych problemów związanych ze stosowaniem technologii CRISPR w detekcji MPXV, takich jak: B. Badania przesiewowe sondą, wydajność analityczna, testy przed amplifikacją i badania w miejscu opieki (POCT). Dlatego w bieżącym badaniu po raz pierwszy zaproponowano szybki i bardzo czuły test, który łączy amplifikację wspomaganą rekombinazą (RAA) i CRISPR/Cas12a, tj. test RAA-Cas12a-MPXV. Zasada obejmowała trzy etapy: wzmocnienie RAA, rozszczepienie CRISPR/Cas12a i wyjście sygnału.

Kluczowe wyniki

W pierwszym etapie selekcja matrycy DNA przez RAA wygenerowała dużą liczbę amplikonów. Zwiększyło to znacznie czułość testu. W drugim etapie aktywowano aktywność rozszczepiania trans Cas12a, co doprowadziło do rozszczepienia licznych reporterów ssDNA. W ostatnim etapie uzyskano dwa różne tryby wyjściowe sygnału: test fluorescencji reporterowej FQ i pasek przepływu bocznego, co poprawiło użyteczność i przydatność testu RAA-Cas12a-MPXV.

Wyniki fluorescencji z lub bez matryc DNA i produktu RAA porównano w celu oceny wykonalności testu. Grupa bez DNA stanowiła kontrolę, która nie wykazała znaczących zmian fluorescencji. Wskazywało to, że w przypadku braku matryc DNA nie wygenerowano amplikonu RAA, który mógłby zostać rozpoznany przez kolejny CRISPR/Cas12a.

Aby zapewnić wyższą selektywność i czułość, zaprojektowano trzy pary starterów, które wiążą się z różnymi miejscami genu F3L specyficznego dla MPXV. Aby znaleźć optymalne startery do przyszłych eksperymentów, przeprowadzono test fluorescencji RAA-Cas12a-MPXV i elektroforezę w żelu agarozowym (AGE). Trzecia para (F2+R2) osiągnęła najjaśniejsze pasmo wzmocnienia właściwego.

Zoptymalizowano wiele ważnych warunków eksperymentalnych związanych z systemem CRISPR/Cas12a i testem RAA-Cas12a-MPXV, skupiając się przede wszystkim na temperaturze i czasie reakcji RAA. Następnie zoptymalizowano system CRISPR/Cas12a za pomocą crRNA2.

Test fluorescencji RAA-Cas12a-MPXV uznano za łatwy w użyciu i odpowiedni do szybkiego testowania. W porównaniu z testem fluorescencyjnym PCR-Cas12a-MPXV, test fluorescencyjny RAA-Cas12a-MPXV wykazał doskonałą czułość z 1000-krotnie dolną granicą wykrywalności (LOD).

Selektywność testu fluorescencji RAA-Cas12a-MPXV określono poprzez porównanie poziomu fluorescencji wytwarzanej przez MPXV z innymi wirusami, takimi jak wirus ospy wietrznej (VARV), wirus ospy krowiej (CPXV) i koronawirus-2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-). CoV-2), wirus Toxoplasma Gondii (TOXV) i wirus afrykańskiego pomoru świń (ASFV). Zarówno obserwacja gołym okiem, jak i wartości fluorescencji wykazały, że tylko MPXV indukował zwiększoną fluorescencję, podczas gdy inne wirusy tego nie robiły.

Reporter FAM-biotyna (reporter FB) został opracowany jako zamiennik reportera FQ w teście fluorescencyjnym, a następnie opracowano test paskowy z przepływem bocznym RAA-Cas12a-MPXV dla POCT. Dodanie roztworu reakcyjnego zawierającego nienaruszone reportery FB rozerwało FAM i biotynę w podkładkach z próbkami i spowodowało szybkie wiązanie kompleksów przeciwciało anty-FAM/AuNP z izolowanymi FAM i reporterami FB w miarę migracji próbki do przodu. Na koniec streptawidyna unieruchomiona na paśmie kontrolnym wychwytywała rozszczepione biotyny i kompleksy reporter FB/przeciwciało anty-FAM/AuNP.

Początkowo pasmo kontrolne wydawało się czerwone z powodu agregacji AuNP. Następnie reszta wyizolowanych kompleksów FAM/przeciwciało anty-FAM/AuNP migrowała do pasma testowego i reagowała z przeciwciałami FAM pojawiającymi się na czerwono. Wreszcie amplikony aktywowały Cas12a, aby rozdzielić wszystkich reporterów FB. Zmiana koloru utrzymała się jedynie na taśmie testowej.

W skrócie, jeśli zmianę koloru zaobserwowano tylko w prążku testowym lub zarówno w prążku kontrolnym, jak i testowym, uznawano to za wynik pozytywny. Natomiast jeśli zmianę barwy zaobserwowano jedynie na prążku kontrolnym, oznaczało to wynik negatywny, tj. h. brak matryc DNA spowodował brak amplikonów do aktywacji Cas12a.

Wnioski

Kluczową zaletą testu RAA-Cas12a-MPXV jest to, że można go przeprowadzić w łagodnej temperaturze w porównaniu z metodami tradycyjnymi. Co ważne, test ten był skuteczną metodą diagnostyczną MPXV o doskonałej selektywności, czułości i przenośności.

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

Referencje:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Rewizje artykułu

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.