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Testes no local para vírus da varíola dos macacos altamente sensíveis usando CRISPR/Cas12a
O vírus Monkeypox (MPXV), isolado pela primeira vez em 1958, é um vírus de DNA de fita dupla (dsDNA). Quando o primeiro caso humano foi detectado na República Democrática do Congo em 1970, a doença foi reconhecida como uma doença zoonótica. Existe actualmente uma preocupação global sobre o MPXV devido à transmissão generalizada da África Central e Ocidental. Para conter a propagação deste vírus, é essencial uma detecção rápida, altamente sensível e específica. Em um novo estudo publicado no servidor de pré-impressão medRxiv*: Pesquisadores na China desenvolveram pela primeira vez um ensaio MPXV que combina repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas e proteína associada a CRISPR (CRISPR/Cas) e amplificação assistida por recombinase (RAA). O …
Testes no local para vírus da varíola dos macacos altamente sensíveis usando CRISPR/Cas12a
O vírus Monkeypox (MPXV), isolado pela primeira vez em 1958, é um vírus de DNA de fita dupla (dsDNA). Quando o primeiro caso humano foi detectado na República Democrática do Congo em 1970, a doença foi reconhecida como uma doença zoonótica. Existe actualmente uma preocupação global sobre o MPXV devido à transmissão generalizada da África Central e Ocidental.
Para conter a propagação deste vírus, é essencial uma detecção rápida, altamente sensível e específica. Em um novo estudo publicado no medRxiv * Servidor de pré-impressão: Pesquisadores na China desenvolveram pela primeira vez um ensaio MPXV que combina repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas e proteína associada a CRISPR (CRISPR/Cas) e amplificação assistida por recombinase (RAA). O ensaio mostrou alta seletividade e pôde distinguir entre MPXV e outros ortopoxvírus.
Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes
fundo
Atualmente, o teste MPXV utiliza métodos como imunoensaio enzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase (PCR) e amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). A PCR é o padrão ouro e é precisa e sensível, mas difícil de usar em áreas com poucos recursos. O ELISA pode dar resultados falsos positivos em vacinações recentes ou distantes, e as desvantagens do LAMP estão relacionadas ao desenho complicado do primer, ao fraco desempenho quantitativo, etc. Atualmente, faltam métodos rápidos, ultrassensíveis e econômicos que facilitem a detecção no local e fácil de MPXV.
Sobre o estudo
CRISPR/Cas foi descoberto pela primeira vez no sistema imunológico adaptativo de procariontes. O sistema CRISPR/Cas12a integra transdução de sinal e biodetecção tem sido usado para detectar vários vírus, incluindo o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2). Oferece muitas vantagens relacionadas a condições amenas, alta sensibilidade, fácil operação e poderosa amplificação de sinal.
Até o momento, não foram relatados problemas críticos relacionados ao uso da tecnologia CRISPR na detecção de MPXV, tais como: B. Triagem da sonda, desempenho analítico, pré-amplificação e testes no local de atendimento (POCT). Portanto, o presente estudo propôs pela primeira vez um ensaio rápido e altamente sensível que combina amplificação assistida por recombinase (RAA) e CRISPR/Cas12a, ou seja, o ensaio RAA-Cas12a-MPXV. O princípio envolveu três etapas: amplificação RAA, clivagem CRISPR/Cas12a e saída do sinal.
Principais resultados
Na primeira etapa, a seleção do modelo de DNA pelo RAA gerou um grande número de amplicons. Isto aumentou significativamente a sensibilidade do ensaio. Na segunda etapa, a atividade de transclivagem de Cas12a foi ativada, levando à clivagem de numerosos repórteres de ssDNA. A etapa final resultou em dois modos diferentes de saída de sinal: ensaio de fluorescência do repórter FQ e faixa de fluxo lateral, o que melhorou a usabilidade e adequação do ensaio RAA-Cas12a-MPXV.
Os resultados de fluorescência com ou sem modelos de DNA e o produto RAA foram comparados para avaliar a viabilidade do ensaio. O grupo sem DNA foi o controle, que não apresentou alteração significativa de fluorescência. Isto indicou que, na ausência de modelos de DNA, não foi gerado nenhum amplicon de RAA que pudesse ser reconhecido por CRISPR/Cas12a subsequente.
Para garantir maior seletividade e sensibilidade, foram projetados três pares de primers que se ligam a diferentes locais do gene F3L específico do MPXV. Para encontrar os iniciadores ideais para experimentos futuros, foram realizados ensaio de fluorescência RAA-Cas12a-MPXV e eletroforese em gel de agarose (AGE). O terceiro par (F2+R2) atingiu a banda de ganho específico mais brilhante.
Muitas condições experimentais importantes relacionadas ao sistema CRISPR/Cas12a e ao ensaio RAA-Cas12a-MPXV foram otimizadas, com a temperatura e o tempo de reação do RAA sendo o foco principal. Em seguida, o sistema CRISPR/Cas12a foi otimizado com crRNA2.
O ensaio de fluorescência RAA-Cas12a-MPXV foi considerado fácil de usar e adequado para testes rápidos. Comparado ao ensaio de fluorescência PCR-Cas12a-MPXV, o ensaio de fluorescência RAA-Cas12a-MPXV demonstrou excelente sensibilidade com um limite inferior de detecção (LOD) de 1.000 vezes.
A seletividade do ensaio de fluorescência RAA-Cas12a-MPXV foi determinada comparando o nível de fluorescência produzida pelo MPXV com outros vírus, como o vírus da varíola (VARV), o vírus da varíola bovina (CPXV) e o coronavírus-2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-). CoV-2), vírus Toxoplasma Gondii (TOXV) e vírus da peste suína africana (PSA). Tanto a observação a olho nu quanto os valores de fluorescência mostraram que apenas o MPXV induziu fluorescência aumentada, enquanto outros vírus não.
O repórter FAM-biotina (repórter FB) foi desenvolvido como um substituto para o repórter FQ do ensaio de fluorescência e posteriormente o ensaio de faixa de fluxo lateral RAA-Cas12a-MPXV para POCT foi estabelecido. A adição de uma solução de reação contendo repórteres FB intactos interrompeu FAMs e biotina nas amostras e causou rápida ligação dos complexos anticorpo anti-FAM/AuNP com FAMs isolados e repórteres FB à medida que a amostra migrava para frente. Finalmente, a estreptavidina imobilizada na banda de controle capturou biotinas clivadas e os complexos repórter FB/anticorpo anti-FAM/AuNP.
Inicialmente, a banda de controle apareceu em vermelho devido à agregação de AuNPs. Posteriormente, o restante dos complexos isolados FAM/anticorpo anti-FAM/AuNP migraram para a banda de teste e reagiram com anticorpos FAM aparecendo em vermelho. Finalmente, os amplicons ativaram o Cas12a para clivar todos os repórteres do FB. A mudança de cor persistiu apenas na fita de teste.
Resumidamente, se a alteração de cor fosse observada apenas na banda teste ou em ambas as bandas controle e teste, era considerado um resultado positivo. Por outro lado, se a mudança de cor fosse observada apenas na banda controle, isso indicava um resultado negativo, ou seja, h. a falta de modelos de DNA resultou na ausência de amplicons para ativação de Cas12a.
Conclusões
Uma principal vantagem do ensaio RAA-Cas12a-MPXV é que ele pode ser realizado a uma temperatura amena em comparação com os métodos tradicionais. É importante ressaltar que este ensaio foi um poderoso método de diagnóstico de MPXV com seletividade, sensibilidade e portabilidade superiores.
Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes
Referências:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1 - Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.
Revisões de artigos
- 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.