Testare la fața locului pentru virusuri foarte sensibile ale variolei maimuțelor folosind CRISPR/Cas12a

Testare la fața locului pentru virusuri foarte sensibile ale variolei maimuțelor folosind CRISPR/Cas12a

Virusul variolei maimuțelor (MPXV), izolat pentru prima dată în 1958, este un virus ADN dublu catenar (dsDNA). Când a fost detectat primul caz uman în Republica Democratică Congo, în 1970, boala a fost recunoscută ca o boală zoonotică. În prezent, există îngrijorări globale cu privire la MPXV din cauza transmiterii pe scară largă din Africa Centrală și de Vest.

Pentru a limita răspândirea acestui virus, detectarea rapidă, foarte sensibilă și specifică este esențială. Într-un nou studiu publicat în medRxiv * Server de pretipărire: Cercetătorii din China au dezvoltat pentru prima dată un test MPXV care combină repetări palindromice scurte grupate, distanțate în mod regulat și proteină asociată CRISPR (CRISPR/Cas) și amplificarea asistată de recombinază (RAA). Testul a arătat o selectivitate ridicată și a putut distinge între MPXV și alte ortopoxvirusuri.

Studiu: Testare la fața locului de înaltă sensibilitate mediată de CRISPR/Cas12a virusului variolei maimuțelor. Sursa imagine: Dotted Yeti / Shutterstock

Acest articol de știri a fost o revizuire a unui raport științific preliminar care nu a fost revizuit de colegi la momentul publicării. De la publicarea sa inițială, raportul științific a fost acum revizuit de colegi și acceptat pentru publicare într-o jurnal academic. Link-uri către rapoartele preliminare și revizuite de colegi pot fi găsite în secțiunea Surse de la sfârșitul acestui articol. Vizualizați sursele

fundal

În prezent, testarea MPXV utilizează metode precum imunotestul enzimatic (ELISA), reacția în lanț a polimerazei (PCR) și amplificarea izotermă mediată de buclă (LAMP). PCR este standardul de aur și este precis și sensibil, dar dificil de utilizat în zonele cu resurse sărace. ELISA ar putea da rezultate fals pozitive în vaccinarea recentă sau la distanță, iar dezavantajele LAMP sunt legate de designul complicat al primerului, performanța cantitativă slabă etc. Metodele rapide, ultra-sensibile și rentabile care să faciliteze detectarea la fața locului și ușoară a MPXV lipsesc în prezent.

Despre studiu

CRISPR/Cas a fost descoperit pentru prima dată în sistemul imunitar adaptativ al procariotelor. Sistemul CRISPR/Cas12a integrează transducția semnalului, iar biodetecția a fost utilizată pentru a detecta mai mulți viruși, inclusiv coronavirusul 2 (SARS-CoV-2) al sindromului respirator acut sever. Oferă multe avantaje legate de condiții blânde, sensibilitate ridicată, operare ușoară și amplificare puternică a semnalului.

Până în prezent, nu au fost raportate probleme critice legate de utilizarea tehnologiei CRISPR în detectarea MPXV, cum ar fi: B. Screeningul sondei, performanța analitică, pre-amplificarea și testarea la punctul de îngrijire (POCT). Prin urmare, studiul actual a propus pentru prima dată un test rapid și foarte sensibil care combină amplificarea asistată de recombinază (RAA) și CRISPR/Cas12a, adică testul RAA-Cas12a-MPXV. Principiul a implicat trei pași: amplificarea RAA, scindarea CRISPR/Cas12a și ieșirea semnalului.

Rezultate cheie

În primul pas, selecția RAA a șablonului ADN a generat un număr mare de ampliconi. Acest lucru a crescut semnificativ sensibilitatea testului. În a doua etapă, activitatea de trans-clivare a Cas12a a fost activată, conducând la scindarea a numeroși reporteri ssDNA. Pasul final a dus la două moduri diferite de ieșire a semnalului: testul de fluorescență cu reporter FQ și banda cu flux lateral, care a îmbunătățit capacitatea de utilizare și adecvarea testului RAA-Cas12a-MPXV.

Rezultatele fluorescenței cu sau fără matrițe ADN și produsul RAA au fost comparate pentru a evalua fezabilitatea testului. Grupul fără ADN a fost martor, care nu a arătat nicio modificare semnificativă a fluorescenței. Acest lucru a indicat că, în absența șabloanelor ADN, nu a fost generat niciun amplicon RAA care ar putea fi recunoscut de către CRISPR/Cas12a ulterioară.

Pentru a asigura o selectivitate și o sensibilitate mai ridicate, au fost proiectate trei perechi de primeri care se leagă la diferite site-uri ale genei F3L specifice MPXV. Pentru a găsi primerii optimi pentru experimentele viitoare, au fost efectuate testul de fluorescență RAA-Cas12a-MPXV și electroforeza pe gel de agaroză (AGE). A treia pereche (F2+R2) a atins cea mai strălucitoare bandă de câștig specifică.

Multe condiții experimentale importante legate de sistemul CRISPR/Cas12a și testul RAA-Cas12a-MPXV au fost optimizate, temperatura și timpul de reacție al RAA fiind principalul obiectiv. Apoi, sistemul CRISPR/Cas12a a fost optimizat cu crRNA2.

Testul de fluorescență RAA-Cas12a-MPXV a fost considerat ușor de utilizat și potrivit pentru testarea rapidă. Comparativ cu testul de fluorescență PCR-Cas12a-MPXV, testul de fluorescență RAA-Cas12a-MPXV a demonstrat o sensibilitate excelentă cu o limită inferioară de detecție (LOD) de 1000 de ori.

Selectivitatea testului de fluorescență RAA-Cas12a-MPXV a fost determinată prin compararea nivelului de fluorescență produs de MPXV cu alte viruși, cum ar fi virusul variolei (VARV), virusul variolei bovine (CPXV) și sindromul respirator acut sever coronavirus-2 (SARS-). CoV-2), virusul Toxoplasma Gondii (TOXV) și virusul pestei porcine africane (ASFV). Atât observația cu ochiul liber, cât și valorile fluorescenței au arătat că numai MPXV a indus fluorescență îmbunătățită, în timp ce alți viruși nu au făcut-o.

Reporterul FAM-biotină (reporter FB) a fost dezvoltat ca înlocuitor pentru reporterul FQ al testului de fluorescență și ulterior a fost stabilit testul cu bandă laterală de flux RAA-Cas12a-MPXV pentru POCT. Adăugarea unei soluții de reacție care conține reporteri FB intacți a perturbat FAM-urile și biotina în tampoanele de probă și a provocat legarea rapidă a complexelor anticorpi anti-FAM/AuNP cu FAM-uri izolate și reporterii FB pe măsură ce proba a migrat înainte. În cele din urmă, streptavidina imobilizată pe banda de control a capturat biotinele scindate și complexele reporter FB/anticorp anti-FAM/AuNP.

Inițial, banda de control a apărut roșie din cauza agregării AuNP-urilor. Ulterior, restul complexelor izolate FAM/anticorp anti-FAM/AuNP au migrat la banda de testare și au reacționat cu anticorpii FAM apărând roșii. În cele din urmă, ampliconii au activat Cas12a pentru a separa toți reporterii FB. Schimbarea culorii a persistat doar pe banda de testare.

Pe scurt, dacă schimbarea culorii a fost observată doar în banda de testare sau în ambele benzi de control și de testare, a fost considerat un rezultat pozitiv. Pe de altă parte, dacă schimbarea culorii a fost observată doar pe banda de control, aceasta a indicat un rezultat negativ, adică h. lipsa șabloanelor ADN a dus la lipsa ampliconilor pentru activarea Cas12a.

Concluzii

Un avantaj cheie al testului RAA-Cas12a-MPXV este că poate fi efectuat la o temperatură ușoară în comparație cu metodele tradiționale. Foarte important, acest test a fost o metodă puternică de diagnosticare MPXV, cu selectivitate, sensibilitate și portabilitate superioare.

Acest articol de știri a fost o revizuire a unui raport științific preliminar care nu a fost revizuit de colegi la momentul publicării. De la publicarea sa inițială, raportul științific a fost acum revizuit de colegi și acceptat pentru publicare într-o jurnal academic. Link-uri către rapoartele preliminare și revizuite de colegi pot fi găsite în secțiunea Surse de la sfârșitul acestui articol. Vizualizați sursele

Referinte:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Revizuirile articolului

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.