Testovanie na mieste na vysoko citlivé vírusy opičích kiahní pomocou CRISPR/Cas12a

Testovanie na mieste na vysoko citlivé vírusy opičích kiahní pomocou CRISPR/Cas12a

Vírus opičích kiahní (MPXV), prvýkrát izolovaný v roku 1958, je vírus s dvojvláknovou DNA (dsDNA). Keď bol v roku 1970 zistený prvý prípad u ľudí v Konžskej demokratickej republike, choroba bola uznaná ako zoonotická choroba. V súčasnosti existuje celosvetové znepokojenie nad MPXV kvôli rozšírenému prenosu zo strednej a západnej Afriky.

Aby sa zabránilo šíreniu tohto vírusu, je nevyhnutná rýchla, vysoko citlivá a špecifická detekcia. V novej štúdii publikovanej v medRxiv * Predtlačový server: Výskumníci v Číne po prvýkrát vyvinuli test MPXV, ktorý kombinuje zoskupené, pravidelne rozmiestnené krátke palindromické opakovania a proteín spojený s CRISPR (CRISPR/Cas) a amplifikáciu za pomoci rekombinázy (RAA). Test ukázal vysokú selektivitu a dokázal rozlíšiť medzi MPXV a inými ortopoxvírusmi.

štúdium: Vysokocitlivé testovanie vírusu opičích kiahní na mieste sprostredkované CRISPR/Cas12a. Zdroj obrázkov: Dotted Yeti / Shutterstock

Tento spravodajský článok bol recenziou predbežnej vedeckej správy, ktorá nebola v čase uverejnenia recenzovaná. Od svojho počiatočného zverejnenia bola vedecká správa teraz recenzovaná a prijatá na publikovanie v akademickom časopise. Odkazy na predbežné a recenzované správy nájdete v časti Zdroje na konci tohto článku. Zobraziť zdroje

pozadia

V súčasnosti sa pri testovaní MPXV používajú metódy ako enzýmová imunoanalýza (ELISA), polymerázová reťazová reakcia (PCR) a izotermická amplifikácia sprostredkovaná slučkou (LAMP). PCR je zlatým štandardom a je presná a citlivá, ale ťažko sa používa v oblastiach s nedostatkom zdrojov. ELISA by mohla poskytnúť falošne pozitívne výsledky pri nedávnom alebo vzdialenom očkovaní a nevýhody LAMP súvisia s komplikovaným návrhom primeru, slabým kvantitatívnym výkonom atď. V súčasnosti chýbajú rýchle, ultracitlivé a nákladovo efektívne metódy, ktoré uľahčujú detekciu MPXV priamo na mieste.

O štúdiu

CRISPR/Cas bol prvýkrát objavený v adaptívnom imunitnom systéme prokaryotov. Systém CRISPR/Cas12a integruje prenos signálu a biodetekcia sa použila na detekciu niekoľkých vírusov vrátane koronavírusu 2 závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV-2). Ponúka mnoho výhod súvisiacich s miernymi podmienkami, vysokou citlivosťou, jednoduchou obsluhou a výkonným zosilnením signálu.

K dnešnému dňu neboli hlásené žiadne kritické problémy súvisiace s používaním technológie CRISPR pri detekcii MPXV, ako napríklad: B. Skríning sondou, analytický výkon, predamplifikácia a testovanie v mieste starostlivosti (POCT). Preto súčasná štúdia po prvýkrát navrhla rýchly a vysoko citlivý test, ktorý kombinuje amplifikáciu za asistencie rekombinázy (RAA) a CRISPR/Cas12a, t.j. test RAA-Cas12a-MPXV. Princíp zahŕňal tri kroky: zosilnenie RAA, štiepenie CRISPR/Cas12a a výstup signálu.

Kľúčové výsledky

V prvom kroku RAA selekcia templátu DNA vygenerovala veľké množstvo amplikónov. To výrazne zvýšilo citlivosť testu. V druhom kroku sa aktivovala trans-štiepna aktivita Cas12a, čo viedlo k štiepeniu mnohých reportérov ssDNA. Posledný krok viedol k dvom rôznym režimom výstupu signálu: FQ reportérový fluorescenčný test a laterálny prietokový pás, čo zlepšilo použiteľnosť a vhodnosť testu RAA-Cas12a-MPXV.

Výsledky fluorescencie s alebo bez templátov DNA a produktu RAA sa porovnali, aby sa vyhodnotila uskutočniteľnosť testu. Skupina bez DNA bola kontrola, ktorá nevykazovala žiadnu významnú zmenu fluorescencie. To naznačuje, že v neprítomnosti templátov DNA sa nevytvoril žiadny amplikón RAA, ktorý by bolo možné rozpoznať následným CRISPR / Cas12a.

Na zabezpečenie vyššej selektivity a citlivosti boli navrhnuté tri páry primérov, ktoré sa viažu na rôzne miesta génu F3L špecifického pre MPXV. Na nájdenie optimálnych primérov pre budúce experimenty sa uskutočnil fluorescenčný test RAA-Cas12a-MPXV a elektroforéza na agarózovom géli (AGE). Tretí pár (F2+R2) dosiahol najjasnejšie pásmo špecifického zisku.

Mnoho dôležitých experimentálnych podmienok súvisiacich so systémom CRISPR/Cas12a a testom RAA-Cas12a-MPXV bolo optimalizovaných, pričom hlavným cieľom bola teplota a reakčný čas RAA. Ďalej bol systém CRISPR / Cas12a optimalizovaný pomocou crRNA2.

Fluorescenčný test RAA-Cas12a-MPXV sa považoval za ľahko použiteľný a vhodný na rýchle testovanie. V porovnaní s fluorescenčným testom PCR-Cas12a-MPXV fluorescenčný test RAA-Cas12a-MPXV preukázal vynikajúcu citlivosť s 1000-násobne nižším limitom detekcie (LOD).

Selektivita fluorescenčného testu RAA-Cas12a-MPXV bola stanovená porovnaním úrovne fluorescencie produkovanej MPXV s inými vírusmi, ako je vírus variola (VARV), vírus kravských kiahní (CPXV) a koronavírus-2 závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-). CoV-2), vírus Toxoplasma Gondii (TOXV) a vírus afrického moru ošípaných (ASFV). Pozorovanie voľným okom aj hodnoty fluorescencie ukázali, že iba MPXV vyvolal zvýšenú fluorescenciu, zatiaľ čo iné vírusy nie.

FAM-biotínový reportér (FB reportér) bol vyvinutý ako náhrada za FQ reportér fluorescenčného testu a následne bol zavedený test RAA-Cas12a-MPXV s laterálnym prietokovým pásikom pre POCT. Pridanie reakčného roztoku obsahujúceho intaktné reportéry FB narušilo FAM a biotín vo vzorkových podložkách a spôsobilo rýchlu väzbu komplexov anti-FAM protilátka/AuNP s izolovanými FAM a FB reportérmi, keď vzorka migrovala dopredu. Nakoniec streptavidín imobilizovaný na kontrolnom páse zachytil štiepené biotíny a komplexy FB reportér/anti-FAM protilátka/AuNP.

Spočiatku sa kontrolný pás javil ako červený v dôsledku agregácie AuNP. Následne zvyšok izolovaných komplexov FAM/anti-FAM protilátka/AuNP migroval do testovacieho prúžku a reagoval s protilátkami FAM, ktoré sa javili ako červené. Nakoniec amplikóny aktivovali Cas12a, aby rozštiepili všetkých FB reportérov. Zmena farby pretrvávala len na testovacej páske.

Stručne povedané, ak bola zmena farby pozorovaná len v testovacom páse alebo v kontrolnom aj testovacom páse, považovala sa to za pozitívny výsledok. Na druhej strane, ak bola zmena farby pozorovaná len na kontrolnom páse, indikovalo to negatívny výsledok, t.j. nedostatok templátov DNA neviedol k žiadnym amplikónom na aktiváciu Cas12a.

Závery

Kľúčovou výhodou testu RAA-Cas12a-MPXV je, že ho možno vykonať pri miernej teplote v porovnaní s tradičnými metódami. Dôležité je, že tento test bol výkonnou diagnostickou metódou MPXV s vynikajúcou selektivitou, citlivosťou a prenosnosťou.

Tento spravodajský článok bol recenziou predbežnej vedeckej správy, ktorá nebola v čase uverejnenia recenzovaná. Od svojho počiatočného zverejnenia bola vedecká správa teraz recenzovaná a prijatá na publikovanie v akademickom časopise. Odkazy na predbežné a recenzované správy nájdete v časti Zdroje na konci tohto článku. Zobraziť zdroje

Referencie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Revízie článku

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.