Testiranje na kraju samem za zelo občutljive viruse opičjih koz z uporabo CRISPR/Cas12a

Testiranje na kraju samem za zelo občutljive viruse opičjih koz z uporabo CRISPR/Cas12a

Virus opičjih koz (MPXV), ki je bil prvič izoliran leta 1958, je virus z dvojno verigo DNA (dsDNA). Ko so leta 1970 v Demokratični republiki Kongo odkrili prvi primer okužbe pri ljudeh, je bila bolezen priznana kot zoonoza. Trenutno obstaja globalna zaskrbljenost zaradi MPXV zaradi razširjenega prenosa iz Srednje in Zahodne Afrike.

Za zajezitev širjenja tega virusa je nujno hitro, zelo občutljivo in specifično odkrivanje. V novi študiji, objavljeni v medRxiv * Strežnik prednatisa: Raziskovalci na Kitajskem so prvič razvili test MPXV, ki združuje združene, redno razmaknjene kratke palindromske ponovitve in protein, povezan s CRISPR (CRISPR/Cas) in pomnoževanje s pomočjo rekombinaze (RAA). Test je pokazal visoko selektivnost in je lahko razlikoval med MPXV in drugimi ortopoksvirusi.

študija: Visoko občutljivo testiranje virusa opičjih koz na kraju samem, posredovano s CRISPR/Cas12a. Vir slike: Dotted Yeti / Shutterstock

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

ozadje

Trenutno testiranje MPXV uporablja metode, kot so encimski imunski test (ELISA), verižna reakcija s polimerazo (PCR) in izotermno pomnoževanje z zanko (LAMP). PCR je zlati standard in je natančen in občutljiv, vendar ga je težko uporabljati na območjih z revnimi viri. ELISA bi lahko dala lažno pozitivne rezultate pri nedavnem ali oddaljenem cepljenju, slabosti LAMP pa so povezane z zapleteno zasnovo primerja, slabo kvantitativno učinkovitostjo itd. Trenutno manjkajo hitre, ultra občutljive in stroškovno učinkovite metode, ki bi olajšale enostavno odkrivanje MPXV na kraju samem.

O študiju

CRISPR/Cas je bil prvič odkrit v adaptivnem imunskem sistemu prokariontov. Sistem CRISPR/Cas12a združuje transdukcijo signala in biodetekcija je bila uporabljena za odkrivanje več virusov, vključno s koronavirusom 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2). Ponuja številne prednosti, povezane z blagimi pogoji, visoko občutljivostjo, enostavnim upravljanjem in močnim ojačanjem signala.

Do danes niso poročali o nobenih kritičnih težavah, povezanih z uporabo tehnologije CRISPR pri odkrivanju MPXV, kot so: B. Preverjanje sonde, analitična učinkovitost, predhodno ojačanje in testiranje na mestu oskrbe (POCT). Zato je trenutna študija prvič predlagala hiter in zelo občutljiv test, ki združuje pomnoževanje s pomočjo rekombinaze (RAA) in CRISPR/Cas12a, tj. test RAA-Cas12a-MPXV. Načelo je vključevalo tri korake: ojačanje RAA, cepitev CRISPR/Cas12a in izhod signala.

Ključni rezultati

V prvem koraku je izbira RAA predloge DNA ustvarila veliko število pomnožev. To je znatno povečalo občutljivost testa. V drugem koraku je bila aktivirana trans-cepitvena aktivnost Cas12a, kar je vodilo do cepitve številnih poročevalcev ssDNA. Končni korak je povzročil dva različna načina izhoda signala: FQ reporter fluorescenčni test in lateral flow strip, kar je izboljšalo uporabnost in primernost testa RAA-Cas12a-MPXV.

Primerjali smo rezultate fluorescence z ali brez predlog DNA in produkta RAA, da bi ocenili izvedljivost testa. Skupina brez DNK je bila kontrola, ki ni pokazala pomembne spremembe fluorescence. To je pokazalo, da v odsotnosti predlog DNK ni bil ustvarjen pomnožek RAA, ki bi ga lahko prepoznal kasnejši CRISPR/Cas12a.

Za zagotovitev večje selektivnosti in občutljivosti so bili zasnovani trije pari primerjev, ki so se vezali na različna mesta MPXV-specifičnega gena F3L. Da bi našli optimalne primerje za prihodnje poskuse, smo izvedli fluorescenčni test RAA-Cas12a-MPXV in elektroforezo v agaroznem gelu (AGE). Tretji par (F2+R2) je dosegel najsvetlejši pas specifičnega ojačanja.

Veliko pomembnih eksperimentalnih pogojev, povezanih s sistemom CRISPR/Cas12a in testom RAA-Cas12a-MPXV, je bilo optimiziranih, pri čemer sta bila glavna pozornost temperatura in reakcijski čas RAA. Nato je bil sistem CRISPR/Cas12a optimiziran s crRNA2.

Fluorescenčni test RAA-Cas12a-MPXV je veljal za enostaven za uporabo in primeren za hitro testiranje. V primerjavi s fluorescenčnim testom PCR-Cas12a-MPXV je fluorescenčni test RAA-Cas12a-MPXV pokazal odlično občutljivost s 1000-kratno spodnjo mejo zaznave (LOD).

Selektivnost testa fluorescence RAA-Cas12a-MPXV je bila določena s primerjavo ravni fluorescence, ki jo proizvaja MPXV, z drugimi virusi, kot so virus noric (VARV), virus kravjih koz (CPXV) in koronavirus-2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-). CoV-2), virus Toxoplasma Gondii (TOXV) in virus afriške prašičje kuge (ASFV). Tako opazovanje s prostim očesom kot vrednosti fluorescence so pokazale, da je samo MPXV povzročil povečano fluorescenco, drugi virusi pa ne.

FAM-biotinski poročevalec (FB poročevalec) je bil razvit kot zamenjava za FQ poročevalec fluorescenčnega testa, nato pa je bil vzpostavljen test RAA-Cas12a-MPXV s trakovi lateralnega toka za POCT. Dodatek reakcijske raztopine, ki je vsebovala nepoškodovane poročevalce FB, je motil FAM in biotin v vzorčnih blazinicah in povzročil hitro vezavo kompleksov protiteles proti FAM/AuNP z izoliranimi poročevalci FAM in FB, ko se je vzorec selil naprej. Končno je streptavidin, imobiliziran na kontrolnem traku, zajel razcepljene biotine in komplekse FB reporter/anti-FAM protitelo/AuNP.

Na začetku je bil kontrolni pas videti rdeč zaradi združevanja AuNP. Nato so preostali izolirani kompleksi protiteles FAM/anti-FAM/AuNP migrirali na testni pas in reagirali s protitelesi FAM, ki so bila videti rdeča. Končno so amplikoni aktivirali Cas12a, da je cepil vse FB poročevalce. Sprememba barve se je ohranila le na testnem traku.

Na kratko, če je bila sprememba barve opažena samo v testnem traku ali tako v kontrolnem kot testnem traku, se je to štelo za pozitiven rezultat. Po drugi strani, če je bila sprememba barve opažena samo na kontrolnem traku, je to pomenilo negativen rezultat, tj. zaradi pomanjkanja predlog DNA ni bilo pomnožev za aktivacijo Cas12a.

Sklepi

Ključna prednost testa RAA-Cas12a-MPXV je, da ga je mogoče izvesti pri blagi temperaturi v primerjavi s tradicionalnimi metodami. Pomembno je, da je bil ta test zmogljiva diagnostična metoda MPXV z vrhunsko selektivnostjo, občutljivostjo in prenosljivostjo.

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

Revizije člankov

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.