使用 CRISPR/Cas12a 对高度敏感的猴痘病毒进行现场测试

使用 CRISPR/Cas12a 对高度敏感的猴痘病毒进行现场测试

猴痘病毒 (MPXV) 于 1958 年首次分离，是一种双链 DNA (dsDNA) 病毒。 1970年，当刚果民主共和国发现第一例人类病例时，该疾病被认为是一种人畜共患疾病。由于中非和西非的广泛传播，目前全球对 MPXV 感到担忧。

为了遏制这种病毒的传播，快速、高灵敏度和特异性的检测至关重要。 在发表在《科学》杂志上的一项新研究中 医学Rxiv * 预印本服务器：中国研究人员首次开发了一种 MPXV 检测方法，将成簇、规则间隔的短回文重复序列与 CRISPR 相关蛋白 (CRISPR/Cas) 和重组酶辅助扩增 (RAA) 相结合。 该检测显示出高选择性，可以区分 MPXV 和其他正痘病毒。

学习： CRISPR/Cas12a介导的高灵敏度现场猴痘病毒检测 。 图片来源：点状雪人/Shutterstock

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

背景

目前，MPXV 检测使用酶免疫分析 (ELISA)、聚合酶链反应 (PCR) 和环介导等温扩增 (LAMP) 等方法。 PCR 是金标准，准确且灵敏，但在资源贫乏地区难以使用。 ELISA在近期或远期接种疫苗时可能会出现假阳性结果，而LAMP的缺点与引物设计复杂、定量性能差等有关。目前缺乏快速、超灵敏且经济有效的、便于现场、轻松检测MPXV的方法。

关于该研究

CRISPR/Cas首先在原核生物的适应性免疫系统中发现。 CRISPR/Cas12a系统集成了信号转导和生物检测，已用于检测多种病毒，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。 它具有条件温和、灵敏度高、操作简便、信号放大能力强等优点。

迄今为止，尚未报道与在 MPXV 检测中使用 CRISPR 技术相关的关键问题，例如： B. 探针筛选、分析性能、预扩增和即时检测 (POCT)。 因此，本研究首次提出了一种结合重组酶辅助扩增（RAA）和CRISPR/Cas12a的快速、高灵敏度检测方法，即RAA-Cas12a-MPXV检测方法。 原理包括三个步骤：RAA 扩增、CRISPR/Cas12a 切割和信号输出。

主要成果

第一步，DNA 模板的 RAA 选择产生了大量的扩增子。 这显着提高了测定的灵敏度。 第二步，Cas12a 的反式切割活性被激活，导致大量 ssDNA 报告基因被切割。 最后一步产生了两种不同的信号输出模式：FQ 报告荧光测定和侧流条，这提高了 RAA-Cas12a-MPXV 测定的可用性和适用性。

比较有或没有 DNA 模板的荧光结果和 RAA 产物，以评估该测定的可行性。 不含DNA的组为对照组，未显示明显的荧光变化。 这表明在没有DNA模板的情况下，不会产生可以被后续CRISPR/Cas12a识别的RAA扩增子。

为了确保更高的选择性和灵敏度，设计了三个引物对，分别结合 MPXV 特异性 F3L 基因的不同位点。 为了寻找未来实验的最佳引物，进行了 RAA-Cas12a-MPXV 荧光测定和琼脂糖凝胶电泳 (AGE)。 第三对（F2+R2）达到最亮的特定增益带。

与CRISPR/Cas12a系统和RAA-Cas12a-MPXV检测相关的许多重要实验条件都得到了优化，其中RAA的温度和反应时间是主要关注点。 接下来，使用 crRNA2 优化 CRISPR/Cas12a 系统。

RAA-Cas12a-MPXV 荧光测定被认为易于使用且适合快速测试。 与 PCR-Cas12a-MPXV 荧光测定相比，RAA-Cas12a-MPXV 荧光测定具有出色的灵敏度，检测下限 (LOD) 低 1000 倍。

RAA-Cas12a-MPXV 荧光检测的选择性是通过比较 MPXV 与其他病毒（如天花病毒 (VARV)、牛痘病毒 (CPXV) 和严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-)）产生的荧光水平来确定的。 CoV-2）、弓形虫病毒（TOXV）和非洲猪瘟病毒（ASFV）。 肉眼观察和荧光值均表明，只有MPXV诱导荧光增强，而其他病毒则没有。

FAM-生物素报告基因（FB 报告基因）被开发为荧光检测中 FQ 报告基因的替代品，随后建立了用于 POCT 的 RAA-Cas12a-MPXV 侧流试纸条检测。 添加含有完整 FB 报告基因的反应溶液会破坏样品垫中的 FAM 和生物素，并在样品向前迁移时导致抗 FAM 抗体/AuNP 复合物与分离的 FAM 和 FB 报告基因快速结合。 最后，固定在对照带上的链霉亲和素捕获切割的生物素和 FB 报告基因/抗 FAM 抗体/AuNP 复合物。

最初，由于 AuNP 的聚集，对照带呈现红色。 随后，其余分离的 FAM/抗 FAM 抗体/AuNP 复合物迁移到测试条带并与呈红色的 FAM 抗体反应。 最后，扩增子激活 Cas12a 以裂解所有 FB 报告基因。 颜色变化仅在测试胶带上持续存在。

简而言之，如果仅在测试带中观察到颜色变化，或者在对照带和测试带中都观察到颜色变化，则认为结果为阳性。 另一方面，如果仅在对照带上观察到颜色变化，则表明结果为阴性，即 h。缺乏 DNA 模板导致没有用于 Cas12a 激活的扩增子。

结论

与传统方法相比，RAA-Cas12a-MPXV 测定的一个关键优势是它可以在温和的温度下进行。 重要的是，该测定是一种强大的 MPXV 诊断方法，具有卓越的选择性、灵敏度和便携性。

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

参考：

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, F. et al. (2022) CRISPR/Cas12a-vermittelte ultrasensitive und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests, medRxiv 2022.10.10.22280931; doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.10.22280931, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.10.22280931v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Zhao, Furong, Pei Wang, Haoxuan Wang, Sirui Liu, Muhammad Sohail, Xing Zhang, Bingzhi Li und He Huang. 2023. „CRISPR/Cas12a-vermittelte hochempfindliche und Vor-Ort-Affenpocken-Virustests.“ Analytische Methoden 15 (17): 2105–13. https://doi.org/10.1039/D2AY01998A. https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D2AY01998A.

文章修改

• 16. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.