Qual é a eficácia dos ensaios RT-PCR para detectar SARS-CoV-2 em esperma humano?

Qual é a eficácia dos ensaios RT-PCR para detectar SARS-CoV-2 em esperma humano?

O surto da pandemia do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) destacou preocupações em relação às amostras de sêmen para criobanco.

Studie: Validierung eines SARS-CoV-2 RT-PCR-Assays: eine Voraussetzung zur Bewertung der Viruskontamination in menschlichem Sperma. Bildnachweis: Leonidovich/Shutterstock

O SARS-CoV-2 usa a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) do receptor hospedeiro e cofatores celulares como TMPRSS2 para entrar nas células-alvo. A viremia transitória durante a infecção por SARS-CoV-2 e a expressão de TMPRSS2 e ACE2 nos testículos e outras glândulas acessórias podem levar à secreção de SARS-CoV-2 no trato reprodutor masculino.

fundo

Embora a replicação do SARS-CoV-2 geralmente não ocorra no sistema reprodutor masculino, certas células masculinas específicas podem atuar como reservatório viral após a infecção sistêmica pelo SARS-CoV-2.

Além disso, pode ocorrer contaminação das amostras de sementes com SARS-CoV-2 durante a colheita de sémen. A possibilidade de SARS-CoV-2 em amostras de sêmen criopreservadas é uma preocupação para pacientes submetidos a tecnologia de reprodução assistida (TARV) e tratamento de preservação da fertilidade.

Até à data, quatro estudos sugeriram a presença do genoma do SARS-CoV-2 em amostras de sémen. Três desses estudos utilizaram ensaios comerciais de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) para avaliar amostras de sêmen, enquanto um não descreveu o mecanismo de detecção do vírus.

No entanto, estes estudos incluíram uma população pequena e não incluíram um método validado para detectar SARS-CoV-2 em amostras de sémen. Além disso, a maioria dos estudos utilizou ensaios comerciais de RT-PCR aprovados apenas para amostras respiratórias e visando apenas dois ou três genes virais.

Três estudos utilizaram PCR digital de gotículas (dd-PCR) para uma boa detecção do genoma do SARS-CoV-2. No entanto, o tipo de amostra utilizado neste método geralmente não eram sementes. A confirmação do limite de detecção (LOD) é necessária para amostras de sêmen em tais estudos.

Outro estudo utilizou um “teste SpermCOVID” para detectar o genoma do SARS-CoV-2 em amostras respiratórias, mas não em amostras de sémen.

Um novo estudo no Biomedicina reprodutiva on-line O objetivo da revista era desenvolver um protocolo padronizado para detecção de RNA SARS-CoV-2 em frações de sêmen usadas para TARV. Este foi um ensaio RT-PCR de alto desempenho que utilizou amostras de esperma e fluido seminal criopreservado para detecção de RNA SARS-CoV-2. Além disso, a eficácia do método também foi determinada com base nas diversas características das sementes.

Sobre o estudo

O estudo envolveu a coleta de amostras de sêmen de pacientes submetidos à análise de sêmen de rotina para infertilidade entre julho de 2020 e março de 2021, independentemente de critérios clínicos, índice de massa corporal ou idade. Nenhum dos pacientes relatou febre ou outros sintomas de SARS-CoV-2. Eles também relataram que não haviam sido expostos a ninguém com sintomas de SARS-CoV-2. Foram então realizadas análise convencional do sêmen, detecção de leucócitos e avaliação morfológica, seguida do preparo da amostra.

As amostras normozoospérmicas foram descongeladas a 4°C e reunidas para testes analíticos. A extração de RNA foi realizada a partir de 160 µl de cada amostra, seguida de amplificação do genoma do SARS-CoV-2 e validação analítica do ensaio RT-PCR do SARS-CoV-2. Foi analisada a influência da qualidade espermática com base na eficácia do RT-PCR. Finalmente, foram realizados testes de precisão, bem como LOD e limite de quantificação (LOQ) para o ensaio RT-PCR do SARS-CoV-2.

Resultados

Os resultados mostraram que os testes de precisão atenderam aos requisitos esperados para tipos de sementes com alta concentração de RNA de SARS-CoV-2, para alvos de vírus N e ORF1ab e para tipos de sementes com baixa concentração de RNA de SARS-CoV-2. Além disso, foi relatado que o gene S era o alvo viral menos sensível do ensaio, enquanto o gene N era o alvo mais sensível.

Observou-se que o meio crioprotetor e as características das sementes não influenciaram a eficácia do método de detecção. O LOD foi relatado como 0,33 cópias do genoma do SARS-CoV-2/µL de amostra para fluido seminal e 0,23 cópias do genoma do SARS-CoV-2/µL para espermatozóides. Finalmente, o LOQ deve ser uma cópia do genoma viral/µl da amostra.

Portanto, este estudo poderia determinar a presença de RNA SARS-CoV-2 em esperma criopreservados e fluido seminal. O método foi eficaz independentemente das características espermáticas e do tipo de sêmen. Assim, este método pode garantir a segurança dos doadores de esperma e dos pacientes que se beneficiam de técnicas de preservação da fertilidade durante a pandemia de SARS-CoV-2.

Referência:

• Chabrolles, H. et al. (2022). Validierung eines SARS-CoV-2 RT-PCR-Assays: eine Voraussetzung zur Bewertung der Viruskontamination in menschlichem Sperma. Reproduktionsbiomedizin online. doi: https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2022.09.004. https://www.rbmojournal.com/article/S1472-6483(22)00684-8/fulltext#latedArticles.