In jeder Zelle kollidieren, überlappen und kompensieren Tausende molekularer Signale, wodurch die wahren Treiber der Genexpression verdeckt werden. Wissenschaftler haben nun eine Möglichkeit entwickelt, dieses zelluläre Rauschen zum Schweigen zu bringen und Transkriptionstreiber aufzudecken, indem sie die Transkription außerhalb der Zelle rekonstruieren.
Dieser Ansatz wird in einem Artikel beschrieben, der in veröffentlicht wurde Molekulare Zelle, konzentriert sich ausschließlich auf die Funktionsweise des Enzyms, das DNA in RNA kopiert, um einzigartige Einblicke in die Funktionsweise von Genen und den Beginn und das Ende der RNA-Synthese zu ermöglichen. Forscher nutzten diese Methode, um grundlegende Merkmale des Transkriptionszyklus – des Prozesses, bei dem Zellen DNA in RNA kopieren, um Proteine herzustellen – bei Mycobacterium tuberculosis (Mtb) aufzudecken. Die Ergebnisse könnten Wissenschaftlern helfen, diesen Krankheitserreger und die Medikamente, die zu seiner Bekämpfung entwickelt wurden, besser zu verstehen.
„Ein tiefes Verständnis der Funktionsweise der Transkription offenbart zentrale Prinzipien der Biologie, die für die menschliche Gesundheit von enormer Bedeutung sind“, sagt Elizabeth Campbell, Leiterin des Labors für molekulare Pathogenese. „Wir können Therapeutika präziser entwickeln, um auf einen Prozess abzuzielen, wenn wir ihn wirklich verstehen.“
Die Suche nach direkten Wirkungen
Bakterien wie Mtb überleben, indem sie genau kontrollieren, welche Gene als Reaktion auf veränderte Bedingungen ein- oder ausgeschaltet werden. Im Zentrum dieses Prozesses stehen die RNA-Polymerase (RNAP), die DNA in RNA kopiert, und eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die mit RNAP interagieren, um die Genaktivität zu optimieren. Diese Interaktionen sind jedoch in dichten, verrauschten Netzwerken innerhalb der Zelle verborgen – einer Umgebung, die die direkten Auswirkungen jedes Transkriptionsfaktors verdeckt.
Um zu verstehen, was ein Transkriptionsfaktor spezifisch steuert, schwächen oder entfernen Wissenschaftler ihn normalerweise und messen dann, welche Gene ihre Aktivität ändern. Theoretisch sollten diese Verschiebungen die direkten Ziele des Transkriptionsfaktors offenbaren. Aber in vielen lebenden Zellen, einschließlich Mtb, löst die Störung eines essentiellen Transkriptionsfaktors eine Notfallkompensation oder einen Zellkollaps aus, was weitreichende Welleneffekte auslöst, die das ursprüngliche Signal des Transkriptionsfaktors übertönen. Mittlerweile erfassen Standard-Genom-Tools nur Fragmente direkter Effekte. Die ChIP-seq-Methode zeigt, wo ein Protein bindet, aber nicht, ob oder wie es die Genaktivität verändert; Die RNA-seq-Methode zeigt, welche Gene sich nach einer Störung verändern, aber nicht, ob diese Veränderungen direkt oder indirekt sind.
„Auf diese Weise können wir keine direkten Ziele identifizieren. Wir haben es immer wieder versucht, und viele andere haben es versucht“, sagt Campbell. „Wenn die Genexpression ein Signalweg ist, dann sehen wir bei der Verwendung dieser Methoden nur den Endpunkt. Wir sehen nie, was entlang des Signalwegs passiert.“
Es wurde eine neue Methode benötigt, unter anderem um die Untersuchung der vielen Organismen zu ermöglichen, die im Labor nicht kultiviert werden können. „Um wirklich allgemeine Prinzipien aufzudecken, muss man in der Lage sein, Proben verschiedener Bakterienstämme zu untersuchen, auch solche, die wir nicht kultivieren können“, sagt Campbell. Diese Dringlichkeit wurde in Mtb noch verstärkt. Ohne die direkten Auswirkungen seiner Transkriptionsfaktoren zu definieren, sind die Forscher nur begrenzt in der Lage, vollständig zu verstehen, wie man diesen Krankheitserreger bekämpfen kann.
Das Campbell-Labor fragte sich, ob die Transkription außerhalb der Zelle wiederhergestellt und untersucht werden könnte. Ein kontrolliertes, zellfreies System könnte die direkten Auswirkungen eines Transkriptionsfaktors ohne Störung aufdecken. Eine solche Methode könnte dazu beitragen, die Transkriptionsregeln verschiedener Arten aufzudecken, von Mtb bis hin zu Organismen, die überhaupt nicht kultiviert werden können.
Zellfreie Genomik
Der Versuch, eine solche Methode zu entwickeln, wurde von Ruby Froom vorangetrieben, damals Doktorandin im Campbell-Labor. „Ich hatte die Idee, zu sehen, ob wir das System in einem Reagenzglas wiederherstellen und direkte Ziele außerhalb der Zelle identifizieren könnten“, erinnert sich Campbell. „Aber Genomik ist nicht mein Fachgebiet. Es erforderte Rubys Kreativität, Genauigkeit und Beharrlichkeit, diese Idee in eine funktionierende Plattform umzusetzen.“
Um den gesamten Prozess in einem kontrollierten, zellfreien Genomsystem zu rekonstruieren, verwendete Froom gereinigte Komponenten von Mtb. Das Team extrahierte und fragmentierte DNA und kombinierte sie dann mit RNAP, seinem primären Sigma-Faktor, Transkriptionsfaktoren und spezifischen Regulatoren, einschließlich CRP, WhiB1, NusA und NusG. Indem sie parallele Reaktionen mit und ohne einzelne Faktoren durchführten, isolierten sie den direkten Einfluss jedes Proteins auf die RNA-Synthese und entwickelten dann Sequenzierungsansätze, um die genauen Genompositionen zu identifizieren, an denen die Transkription beginnt und endet, und so die genaue Aktivität von RNAP zu kartieren. Mithilfe maßgeschneiderter Computeranalysen quantifizierten die Forscher dann, wie jeder Faktor die Genaktivität veränderte, und identifizierten die DNA-Muster, die diese Veränderungen verursachten. Sie verglichen die Ergebnisse in lebenden Zellen und validierten wichtige Vorhersagen mit präzisen Einzelgenexperimenten.
Sie fanden heraus, dass das System grundlegende Regeln dafür enthüllte, wie Mtb seine Gene steuert. Mit ihrer neuen Methode zeigte das Campbell-Labor, dass die Transkriptionsmaschinerie des Bakteriums auf klassischen DNA-Startsignalen beruht, die in lebenden Zellen schwach oder nicht vorhanden erschienen, was darauf hindeutet, dass diese Signale bisher maskiert wurden. Das Team war außerdem in der Lage, den kompletten Satz von Genen zu kartieren, die direkt von einem bekannten Regulator namens CRP gesteuert werden, und dabei Dutzende davon zu erkennen, dass er unabhängig und ohne die Hilfe anderer zellulärer Faktoren reguliert. In einigen Fällen trennte die Methode sogar die wahre Ursache vom Kollateralschaden und zeigte, dass scheinbar globale Regulatoren in lebenden Zellen oft weitaus präziser sind. Das Team fand heraus, dass der Transkriptionsfaktor WhiB1 beispielsweise nur einen kleinen Satz kritischer Gene direkt kontrolliert, obwohl seine Störung in lebenden Zellen weit verbreitetes Chaos auslöst.
Dieser zellfreie Ansatz half dem Team auch dabei, eine langjährige Debatte darüber zu lösen, wie die Transkription endet, indem er zeigte, dass die sequenzgesteuerte Terminierung im gesamten Mtb-Genom wirksam ist, und die unterschiedlichen Rollen von NusA und NusG klärte. „NusG ist der einzige Transkriptionsfaktor, der in allen Lebensbereichen, von Bakterien bis hin zum Menschen, konserviert ist“, sagt Campbell. „Diese Ergebnisse positionieren Mtb als leistungsstarkes System zur Aufdeckung universeller Prinzipien der Genregulation.“
Obwohl sie wirkungsvoll ist, betont Campbell, dass die neue Methode bestehende Techniken erweitern und nicht ersetzen soll. „Unser Ansatz ergänzt aktuelle genomische Methoden, um die direkten Auswirkungen von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen“, sagt Campbell.
Die Auswirkungen der neuen Methode gehen über die grundlegende Biologie hinaus. RNA-Polymerase ist das Ziel von Rifampicin, einem Medikament gegen Tuberkulose, und diese neue Methode könnte Forschern dabei helfen, die genaue Wirkungsweise besser zu verstehen – und bei zunehmender Resistenz neue Erkenntnisse zu gewinnen.
Über Tuberkulose hinaus stellt die Studie implizit die seit langem bestehende Abhängigkeit von klassischen Modellorganismen wie E. coli zur Definition der Grundregeln der Genregulation in Frage. Durch die direkte Untersuchung der Transkription in einem anderen Organismus legt die Arbeit nahe, dass wichtige Aspekte der Genkontrolle verborgen bleiben können, wenn sich Wissenschaftler nur auf einen experimentellen Rahmen verlassen.
„Mit dieser Methode versuchen wir nicht nur zu sehen, wie Mtb im Vergleich zu Standardmodellen abschneidet. Wir etablieren neue Prinzipien der Genexpression und decken solche auf, die in anderen Organismen noch nicht berücksichtigt wurden“, sagt Campbell. „Es gibt kein ‚Modell‘ mehr. Genauso wie es keinen Modellmenschen oder eine Modellkultur gibt, sind alle Bakterien unterschiedlich. Wir sollten alles untersuchen.“
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