Несъответствията в последователностите на праймера и сондата на настоящите диагностични тестове за вируса на маймунската шарка трябва да бъдат коригирани, за да се подобри точността на откриване

Несъответствията в последователностите на праймера и сондата на настоящите диагностични тестове за вируса на маймунската шарка трябва да бъдат коригирани, за да се подобри точността на откриване

В скорошно проучване, публикувано в medRxiv * Preprint Server, Изследователите анализираха последователностите на праймера и сондата на препоръчаните от Центъра за контрол и превенция на заболяванията (CDC) генерични тестове за полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време за вируса на маймунската шарка (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

фон

MPXV, вид от рода Orthopoxvirus, има геном на двойноверижна дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК). Световната здравна организация (СЗО) обяви възраждането на MPXV за извънредна ситуация за общественото здраве на 23 юли 2022 г., след като бяха докладвани над 66 000 случая в 106 страни. MPXV е вторият такъв вирус, който се разпространява бързо в световен мащаб, след като тежкият остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) постепенно се превърна в ендемичен вирус.

По отношение на SARS-CoV-2, CDC публикува PCR тест в реално време за откриване на MPXV в проби от отпадъчни води, използвайки генерични праймери и сонди, насочени към щам MPXV от Западна Африка и басейна на Конго. По същия начин други PCR анализи в реално време откриват MPXV в клинични проби.

Проблемът е, че праймерите и пробите, използвани в тези генерични PCR анализи, се основават на MPXV щамове, които са циркулирали преди почти десетилетие между 2002 и 2009 г. Като се има предвид бързата еволюция на всички ДНК вируси, регионите, насочени от тези олигонуклеотиди, използвани за откриване на MPXV, трябва да са претърпели значителни мутации.

Относно изследването

В настоящото проучване изследователите извлякоха 683 пълни MPXV генома от базата данни на Глобалната инициатива за данни за инфлуенца по птиците (GISAID), достъпна до 5 август 2022 г., и подравниха техните олиго последователности с праймерните последователности на използваните в момента MPXV диагностични тестове. В допълнение, те подравняват последователностите на праймера и сондата и техните обратни комплементи в седемте PCR анализа в реално време към 1779 MPXV генома и изчисляват процента на геномите със 100% съгласие. Тези анализи са насочени към гените O2L, F3L, C3L и G2R за откриване на MPXV.

Екипът също така оцени три PCR анализа в реално време за откриване на вируси от рода Orthopoxvirus. И накрая, изследователите синтезираха праймерите с коригирана несъответствие или синтетичен MPXV генен фрагмент, за да тестват ефектите на несъответствието и ги сравниха с общия анализ за откриване на MPXV.

Резултати от изследването

Те са използвали 1730 пълни генома MPXV, взети по време на глобалната епидемия през 2022 г. Подравняването на трите олиго последователности и техните обратни комплементи от генеричните MPXV анализи даде генерични MPXV предни последователности (MPXV-F) със 100% идентичност с четири генома и генерични обратни праймери (MPXV-R), които съответстват на 1,73% от геномите. В допълнение, изследователите откриха 31 несъответствия на последователности в 99,08% и 97,46% от MPXV генеричните предни последователности (MPXV-F) и 32 генерични обратни праймера (MPXV-R), съответно.

Докато първият има една единствена синонимна мутация, A194165G, в 99,08% от публикуваните MPXV геноми, последният има несинонимно заместване, G194233A, в 97,46% от геномите. Напротив, последователността на пробата MPXV (MPV-P) беше запазена и съпоставена с 99,31% от геномите в базата данни.

Основното откритие на проучването е, че използваните в момента генерични MPXV тестове може да не открият оптимално и точно MPXV. Независимо от позицията, всяко несъответствие в последователността на праймера може да намали термичната стабилност на ДНК дуплекса праймер-шаблон и да повлияе на ефективността на PCR. Авторите отбелязват несъответствие между два шаблона на праймера, които имат комбинирано въздействие върху ефективността на PCR. Той даде приблизително 11 пъти по-лоша оценка на първоначалната шаблонна ДНК и четирикратно увеличение на границата на откриване (LOD) от 95%. Следователно анализът с коригирана несъответствие с абсолютна комплементарност между праймери и настоящи MPXV геноми може да позволи по-чувствително и точно откриване на MPXV.

В допълнение, резултатите от изследването показват, че генетичните вариации в регионите на праймер-сондата на MPXV генома могат да показват времеви и пространствени модели на поява на болестта на маймунската шарка. Три анализа, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 и OPV_F8L, показаха най-висок резултат на съответствие над >99% с глобалната база данни за генома MPXV през 2022 г. Изборът на анализ обаче също варира в зависимост от типа на пробата. Например, тези три теста работят добре за клинични проби, но не и за проби от отпадъчни води, които могат да съдържат човешки отпадъци, както и изпражнения от котки, кучета, мишки, зайци и крави.

Диплома

Анализът с коригирана несъответствие, разработен в проучването, демонстрира над 97% комплементарност към MPXV геномите. По този начин той показа по-висока чувствителност и подобрен потенциал за количествено определяне и може да подпомогне откриването на MPXV.

Подобрените възможности за диагностика на MPXV са от решаващо значение, тъй като служителите в общественото здравеопазване и лекарите се борят с огнището на MPXV. Следователно бъдещите проучвания трябва да се съсредоточат върху разработването на още по-добър MPXV диагностичен анализ, който взема предвид други фактори, които влияят на диагностичната ефективност и свързаните с несъответствието ефекти (напр. качеството на шаблонна ДНК, PCR основна смес и образуване на праймер-димер).

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

препратки:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Ревизии на статиите

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.