Neshody v sekvencích primeru a sondy současných diagnostických testů viru opičích neštovic je třeba opravit, aby se zlepšila přesnost detekce

Neshody v sekvencích primeru a sondy současných diagnostických testů viru opičích neštovic je třeba opravit, aby se zlepšila přesnost detekce

V nedávné studii publikované v medRxiv * Preprint Server, výzkumníci analyzovali sekvence primerů a sond Centra pro kontrolu a prevenci nemocí Spojených států (CDC), doporučené generické testy polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase pro virus opičích neštovic (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

pozadí

MPXV, druh rodu Orthopoxvirus, má dvouvláknový genom deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Světová zdravotnická organizace (WHO) vyhlásila obnovení MPXV 23. července 2022 za stav ohrožení veřejného zdraví poté, co bylo hlášeno více než 66 000 případů ve 106 zemích. MPXV je druhým takovým virem, který se rychle šíří po celém světě poté, co se koronavirus těžkého akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2) postupně stal endemickým virem.

Pokud jde o SARS-CoV-2, CDC zveřejnilo test PCR v reálném čase pro detekci MPXV ve vzorcích odpadních vod pomocí generických primerů a sond zaměřených na kmen MPXV ze západní Afriky a Konga. Podobně další testy PCR v reálném čase detekují MPXV v klinických vzorcích.

Problém je v tom, že primery a sondy používané v těchto generických PCR testech jsou založeny na kmenech MPXV, které cirkulovaly téměř před deseti lety v letech 2002 až 2009. Vzhledem k rychlé evoluci všech DNA virů musely oblasti, na které se zaměřují tyto oligo používané pro detekci MPXV, prodělat významné mutace.

O studiu

V této studii výzkumníci získali 683 kompletních genomů MPXV z databáze Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), dostupné do 5. srpna 2022, a porovnali své oligo sekvence se sekvencemi primerů aktuálně používaných diagnostických testů MPXV. Kromě toho porovnali sekvence primeru a sondy a jejich reverzní komplementy v sedmi testech PCR v reálném čase na 1 779 genomů MPXV a vypočítali procento genomů se 100% shodou. Tyto testy se zaměřily na geny O2L, F3L, C3L a G2R pro detekci MPXV.

Tým také vyhodnotil tři testy PCR v reálném čase pro detekci virů z rodu Orthopoxvirus. Nakonec výzkumníci syntetizovali primery s korekcí chybného párování nebo syntetický fragment genu MPXV, aby otestovali účinky nesprávného párování a porovnali je s generickým testem pro detekci MPXV.

Výsledky studie

Použili 1 730 kompletních genomů MPXV odebraných během celosvětové epidemie v roce 2022. Porovnání tří oligo sekvencí a jejich reverzních komplementů z generických testů MPXV poskytlo generické přímé sekvence MPXV (MPXV-F) se 100% identitou se čtyřmi genomy a generickými reverzními primery (MPXV-R), které odpovídaly 1,73 % genomů. Kromě toho výzkumníci zjistili 31 neshod sekvencí v 99,08 % a 97,46 % generických dopředných sekvencí MPXV (MPXV-F) a 32 generických reverzních primerů (MPXV-R).

Zatímco první měl jedinou synonymní mutaci, A194165G, v 99,08 % publikovaných genomů MPXV, druhý měl nesynonymní substituci, G194233A, v 97,46 % genomů. Naopak sekvence sondy MPXV (MPV-P) byla konzervovaná a shodná s 99,31 % genomů v databázi.

Primárním zjištěním studie bylo, že v současnosti používané generické testy MPXV nemusí optimálně a přesně detekovat MPXV. Bez ohledu na polohu by jakákoliv neshoda v sekvenci primeru mohla snížit tepelnou stabilitu duplexu DNA primer-templát a ovlivnit výkon PCR. Autoři zaznamenali nesoulad mezi dvěma templáty primerů, který měl kombinovaný dopad na výkon PCR. Poskytl přibližně 11krát horší odhad počáteční templátové DNA a čtyřnásobné zvýšení limitu detekce (LOD) o 95 %. Proto by test s korekcí chybného párování s absolutní komplementaritou mezi primery a současnými genomy MPXV mohl umožnit citlivější a přesnější detekci MPXV.

Kromě toho výsledky studie ukázaly, že genetické variace v oblastech primer-sonda genomu MPXV by mohly naznačovat časový a prostorový vzorec výskytu onemocnění opičích neštovic. Tři testy, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 a OPV_F8L, vykázaly v roce 2022 nejvyšší skóre shody přes >99 % s globální databází genomu MPXV. Výběr testu se však také liší v závislosti na typu vzorku. Například tyto tři testy fungovaly dobře pro klinické vzorky, ale ne pro vzorky odpadních vod, které mohly obsahovat lidský odpad a také výkaly od koček, psů, myší, králíků a krav.

Diplom

Test s korekcí chybného párování vyvinutý ve studii prokázal více než 97% komplementaritu s MPXV genomy. Vykázal tedy vyšší citlivost a zlepšený kvantifikační potenciál a mohl pomoci detekci MPXV.

Vylepšené diagnostické schopnosti MPXV jsou zásadní, protože úředníci veřejného zdraví a lékaři bojují proti vypuknutí MPXV. Budoucí studie by se proto měly zaměřit na vývoj ještě lepšího diagnostického testu MPXV, který bere v úvahu další faktory, které ovlivňují diagnostickou účinnost a účinky související s neshodou (např. kvalita templátové DNA, PCR master mix a tvorba primer-dimeru).

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Revize článku

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.