Uoverensstemmelser i primer- og probesekvenserne af aktuelle abepoxvirus-diagnostiske tests skal korrigeres for at forbedre detektionsnøjagtigheden

Uoverensstemmelser i primer- og probesekvenserne af aktuelle abepoxvirus-diagnostiske tests skal korrigeres for at forbedre detektionsnøjagtigheden

I en nylig undersøgelse offentliggjort i medRxiv * Preprint Server, Forskere analyserede primer- og probesekvenserne fra de amerikanske Centers for Disease Control and Prevention (CDC) anbefalede generiske real-time polymerase chain reaction (PCR) tests for abekoppevirus (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

baggrund

MPXV, en art af slægten Orthopoxvirus, har et dobbeltstrenget deoxyribonukleinsyre (DNA) genom. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) erklærede genopblussen af ​​MPXV for en folkesundhedsnødsituation den 23. juli 2022, efter at over 66.000 tilfælde blev rapporteret i 106 lande. MPXV er den anden sådan virus, der spredes hurtigt over hele verden, efter at alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gradvist blev en endemisk virus.

Med hensyn til SARS-CoV-2 offentliggjorde CDC en real-time PCR-test til MPXV-detektion i spildevandsprøver ved hjælp af generiske primere og prober rettet mod en vestafrikansk og en Congo Basin MPXV-stamme. Ligeledes detekterer andre realtids-PCR-assays MPXV i kliniske prøver.

Problemet er, at de primere og prober, der anvendes i disse generiske PCR-assays, er baseret på MPXV-stammer, der cirkulerede for næsten et årti siden mellem 2002 og 2009. I betragtning af den hurtige udvikling af alle DNA-vira, må de regioner, der er målrettet af disse oligoer, der anvendes til MPXV-detektion, have gennemgået betydelige mutationer.

Om studiet

I denne undersøgelse hentede forskerne 683 komplette MPXV-genomer fra databasen Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID), tilgængelig indtil 5. august 2022, og justerede deres oligosekvenser med primersekvenserne af aktuelt anvendte MPXV-diagnostiske tests. Derudover justerede de primer- og probesekvenser og deres omvendte komplementer i de syv real-time PCR-assays til 1.779 MPXV-genomer og beregnede procentdelen af ​​genomer med 100 % overensstemmelse. Disse analyser målrettede O2L-, F3L-, C3L- og G2R-generne til MPXV-detektion.

Holdet evaluerede også tre real-time PCR-assays til påvisning af vira fra Orthopoxvirus-slægten. Til sidst syntetiserede forskerne de mismatch-korrigerede primere eller et syntetisk MPXV-genfragment for at teste mismatch-effekterne og sammenlignede dem med det generiske assay til MPXV-detektion.

Studieresultater

De brugte 1.730 komplette MPXV-genomer udtaget under det globale udbrud i 2022. Justering af de tre oligosekvenser og deres omvendte komplementer fra de generiske MPXV-assays gav generiske MPXV-forward-sekvenser (MPXV-F) med 100 % identitet til fire genomer og generiske reverse primere (MPXV-R), der matchede 1,73 % af genomerne. Derudover fandt forskere 31 sekvensfejl i henholdsvis 99,08 % og 97,46 % af MPXV generiske fremadsekvenser (MPXV-F) og 32 generiske reverse primere (MPXV-R).

Mens førstnævnte havde en enkelt synonym mutation, A194165G, i 99,08% af de publicerede MPXV-genomer, havde sidstnævnte en ikke-synonym substitution, G194233A, i 97,46% af genomerne. Tværtimod blev MPXV-probesekvensen (MPV-P) konserveret og matchet til 99,31% af genomerne i databasen.

Undersøgelsens primære konklusion var, at aktuelt anvendte generiske MPXV-tests muligvis ikke optimalt og præcist detekterer MPXV. Uanset position kan enhver mismatch inden for primersekvensen reducere den termiske stabilitet af primer-template-DNA-dupleksen og påvirke PCR-ydelsen. Forfatterne bemærkede et misforhold mellem to primer-skabeloner, der havde en kombineret indvirkning på PCR-ydelse. Det gav et cirka 11 gange dårligere estimat af det oprindelige template DNA og en fire gange stigning i detektionsgrænsen (LOD) på 95 %. Derfor kunne det mismatch-korrigerede assay med absolut komplementaritet mellem primere og nuværende MPXV-genomer muliggøre mere følsom og nøjagtig MPXV-detektion.

Derudover viste undersøgelsesresultaterne, at genetiske variationer i primer-probe-regionerne af MPXV-genomet kunne indikere et tidsmæssigt og rumligt mønster for fremkomst af abekopper. Tre assays, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 og OPV_F8L, viste den højeste overensstemmelsesscore på over >99 % med den globale MPXV-genomdatabase i 2022. Valget af assay varierer dog også afhængigt af prøvetypen. For eksempel fungerede disse tre tests godt for kliniske prøver, men ikke for spildevandsprøver, som kunne indeholde menneskeligt affald samt afføring fra katte, hunde, mus, kaniner og køer.

Eksamensbevis

Det mismatch-korrigerede assay udviklet i undersøgelsen viste over 97% komplementaritet til MPXV-genomer. Således viste den højere følsomhed og forbedret kvantificeringspotentiale og kunne hjælpe MPXV-detektion.

Forbedrede MPXV-diagnosefunktioner er afgørende, da offentlige sundhedsembedsmænd og læger bekæmper MPXV-udbruddet. Fremtidige undersøgelser bør derfor fokusere på at udvikle et endnu bedre MPXV diagnostisk assay, der tager højde for andre faktorer, der påvirker diagnostisk effektivitet og mismatch-relaterede effekter (f.eks. kvaliteten af ​​template DNA, PCR master mix og primer-dimer dannelse).

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Referencer:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Artikel revisioner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.