Es necesario corregir las discrepancias en las secuencias de cebadores y sondas de las pruebas de diagnóstico actuales del virus de la viruela simica para mejorar la precisión de la detección.

Es necesario corregir las discrepancias en las secuencias de cebadores y sondas de las pruebas de diagnóstico actuales del virus de la viruela simica para mejorar la precisión de la detección.

En un estudio reciente publicado en medRxiv * Servidor de preimpresión, los investigadores analizaron las secuencias de cebadores y sondas de las pruebas genéricas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real recomendadas por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos para el virus de la viruela del simio (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados ​​por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes

fondo

MPXV, una especie del género Orthopoxvirus, tiene un genoma de ácido desoxirribonucleico (ADN) bicatenario. La Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró el resurgimiento del MPXV una emergencia de salud pública el 23 de julio de 2022, después de que se informaran más de 66.000 casos en 106 países. MPXV es el segundo virus de este tipo que se propaga rápidamente por todo el mundo después de que el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática se convirtiera gradualmente en un virus endémico.

Con respecto al SARS-CoV-2, los CDC publicaron una prueba de PCR en tiempo real para la detección de MPXV en muestras de aguas residuales utilizando cebadores y sondas genéricos dirigidos a una cepa de MPXV de África occidental y de la cuenca del Congo. Asimismo, otros ensayos de PCR en tiempo real detectan MPXV en muestras clínicas.

El problema es que los cebadores y sondas utilizados en estos ensayos de PCR genéricos se basan en cepas de MPXV que circularon hace casi una década, entre 2002 y 2009. Dada la rápida evolución de todos los virus de ADN, las regiones a las que se dirigen estos oligos utilizados para la detección de MPXV deben haber sufrido mutaciones significativas.

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores recuperaron 683 genomas completos de MPXV de la base de datos de la Iniciativa Global sobre Datos de Influenza Aviar (GISAID), disponible hasta el 5 de agosto de 2022, y alinearon sus secuencias oligo con las secuencias de cebadores de las pruebas de diagnóstico de MPXV utilizadas actualmente. Además, alinearon secuencias de cebadores y sondas y sus complementos inversos en los siete ensayos de PCR en tiempo real con 1.779 genomas de MPXV y calcularon el porcentaje de genomas con una concordancia del 100 %. Estos ensayos se dirigieron a los genes O2L, F3L, C3L y G2R para la detección de MPXV.

El equipo también evaluó tres ensayos de PCR en tiempo real para la detección de virus del género Orthopoxvirus. Finalmente, los investigadores sintetizaron los cebadores corregidos por falta de coincidencia o un fragmento sintético del gen MPXV para probar los efectos de la falta de coincidencia y los compararon con el ensayo genérico para la detección de MPXV.

Resultados del estudio

Utilizaron 1.730 genomas completos de MPXV muestreados durante el brote global de 2022. La alineación de las tres secuencias oligo y sus complementos inversos de los ensayos genéricos de MPXV produjo secuencias directas genéricas de MPXV (MPXV-F) con 100% de identidad con cuatro genomas y cebadores inversos genéricos (MPXV-R) que coincidían con el 1,73% de los genomas. Además, los investigadores encontraron 31 discrepancias de secuencia en el 99,08% y el 97,46% de las secuencias directas genéricas de MPXV (MPXV-F) y 32 cebadores inversos genéricos (MPXV-R), respectivamente.

Mientras que el primero tenía una única mutación sinónima, A194165G, en el 99,08% de los genomas de MPXV publicados, el segundo tenía una sustitución no sinónima, G194233A, en el 97,46% de los genomas. Por el contrario, la secuencia de la sonda MPXV (MPV-P) se conservó y coincidió con el 99,31% de los genomas de la base de datos.

El hallazgo principal del estudio fue que las pruebas MPXV genéricas que se utilizan actualmente pueden no detectar MPXV de manera óptima y precisa. Independientemente de la posición, cualquier falta de coincidencia dentro de la secuencia del cebador podría reducir la estabilidad térmica del dúplex de ADN cebador-molde y afectar el rendimiento de la PCR. Los autores observaron una discrepancia entre dos plantillas de cebador que tuvo un impacto combinado en el rendimiento de la PCR. Dio una estimación aproximadamente 11 veces peor del ADN molde inicial y un aumento de cuatro veces en el límite de detección (LOD) del 95%. Por lo tanto, el ensayo corregido por desajustes con complementariedad absoluta entre los cebadores y los genomas actuales de MPXV podría permitir una detección de MPXV más sensible y precisa.

Además, los resultados del estudio mostraron que las variaciones genéticas en las regiones cebador-sonda del genoma MPXV podrían indicar un patrón temporal y espacial de aparición de la viruela simica. Tres ensayos, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 y OPV_F8L, mostraron la puntuación de concordancia más alta de más del 99 % con la base de datos global del genoma MPXV en 2022. Sin embargo, la elección del ensayo también varía según el tipo de muestra. Por ejemplo, estas tres pruebas funcionaron bien para muestras clínicas, pero no para muestras de aguas residuales, que podrían contener desechos humanos además de heces de gatos, perros, ratones, conejos y vacas.

Diploma

El ensayo corregido por discrepancias desarrollado en el estudio demostró una complementariedad de más del 97 % con los genomas de MPXV. Por lo tanto, mostró una mayor sensibilidad y un potencial de cuantificación mejorado y podría ayudar a la detección de MPXV.

Es fundamental mejorar las capacidades de diagnóstico de MPXV mientras los funcionarios de salud pública y los médicos combaten el brote de MPXV. Por lo tanto, los estudios futuros deberían centrarse en desarrollar un ensayo de diagnóstico de MPXV aún mejor que tenga en cuenta otros factores que influyen en la eficiencia del diagnóstico y los efectos relacionados con los desajustes (p. ej., la calidad del ADN molde, la mezcla maestra de PCR y la formación de dímeros de cebador).

Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados ​​por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes

Referencias:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Revisiones de artículos

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.