Nykyisten apinapoxviruksen diagnostisten testien aluke- ja koetinsekvenssien yhteensopimattomuudet on korjattava havaitsemistarkkuuden parantamiseksi

Nykyisten apinapoxviruksen diagnostisten testien aluke- ja koetinsekvenssien yhteensopimattomuudet on korjattava havaitsemistarkkuuden parantamiseksi

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa medRxiv * Preprint Server, tutkijat analysoivat Yhdysvaltain tautien torjunta- ja ehkäisykeskuksen (CDC) aluke- ja koetinsekvenssejä, jotka suosittelivat yleisiä reaaliaikaisia ​​polymeraasiketjureaktiotestejä (PCR) apinapoxvirukselle (MPXV).

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

tausta

MPXV, Orthopoxvirus-suvun laji, jolla on kaksijuosteinen deoksiribonukleiinihapon (DNA) genomi. Maailman terveysjärjestö (WHO) julisti MPXV:n uudelleen puhkeamisen kansanterveyshätätilanteeksi 23. heinäkuuta 2022 sen jälkeen, kun yli 66 000 tapausta raportoitiin 106 maassa. MPXV on toinen tällainen virus, joka on levinnyt nopeasti maailmanlaajuisesti sen jälkeen, kun vakavasta akuutista hengitystieoireyhtymästä koronavirus 2:sta (SARS-CoV-2) tuli vähitellen endeeminen virus.

Mitä tulee SARS-CoV-2:een, CDC julkaisi reaaliaikaisen PCR-testin MPXV:n havaitsemiseksi jätevesinäytteissä käyttämällä yleisiä alukkeita ja koettimia, jotka on kohdistettu Länsi-Afrikan ja Kongon alueen MPXV-kantaan. Samoin muut reaaliaikaiset PCR-määritykset havaitsevat MPXV:n kliinisistä näytteistä.

Ongelmana on, että näissä yleisissä PCR-määrityksissä käytetyt alukkeet ja koettimet perustuvat MPXV-kantoihin, jotka kiertävät lähes kymmenen vuotta sitten vuosina 2002-2009. Kaikkien DNA-virusten nopean evoluution vuoksi näiden MPXV-detektioon käytettyjen oligojen kohteena olevien alueiden on täytynyt käydä läpi merkittäviä mutaatioita.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat hakivat 683 täydellistä MPXV-genomia Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID) -tietokannasta, joka oli saatavilla 5. elokuuta 2022 asti, ja kohdistavat oligosekvenssinsä tällä hetkellä käytettyjen MPXV-diagnostisten testien alukesekvenssien kanssa. Lisäksi he kohdistavat aluke- ja koetinsekvenssit ja niiden käänteiset komplementit seitsemässä reaaliaikaisessa PCR-määrityksessä 1 779 MPXV-genomiin ja laskivat genomien prosenttiosuuden 100-prosenttisesti. Nämä määritykset kohdistuivat O2L-, F3L-, C3L- ja G2R-geeneihin MPXV:n havaitsemiseksi.

Ryhmä arvioi myös kolme reaaliaikaista PCR-määritystä Orthopoxvirus-suvun virusten havaitsemiseksi. Lopuksi tutkijat syntetisoivat yhteensopimattomuuskorjatut alukkeet tai synteettisen MPXV-geenifragmentin epäsopivuusvaikutusten testaamiseksi ja vertasivat niitä yleiseen määritykseen MPXV:n havaitsemiseksi.

Tutkimustulokset

He käyttivät 1 730 täydellistä MPXV-genomia, jotka otettiin näytteitä vuoden 2022 maailmanlaajuisen epidemian aikana. Kolmen oligosekvenssin ja niiden käänteisten komplementtien kohdistaminen geneerisistä MPXV-määrityksistä tuotti geneerisiä MPXV-forward-sekvenssejä (MPXV-F), jotka olivat 100-prosenttisesti identtisiä neljän genomin kanssa, ja geneerisiä käänteisalukkeita (MPXV-R), jotka sopivat 1,73 %:iin genomeista. Lisäksi tutkijat löysivät 31 sekvenssien yhteensopimattomuutta 99,08 %:ssa ja 97,46 %:ssa MPXV:n geneerisistä eteenpäin suuntautuvista sekvensseistä (MPXV-F) ja 32 geneerisestä käänteisalukkeesta (MPXV-R).

Edellisellä oli yksi synonyymi mutaatio, A194165G, 99,08 prosentissa julkaistuista MPXV-genomeista, kun taas jälkimmäisellä oli ei-synonyymi substituutio, G194233A, 97,46 prosentissa genomeista. Päinvastoin, MPXV-koetinsekvenssi (MPV-P) oli konservoitunut ja sovitettu 99,31 %:iin tietokannan genomeista.

Tutkimuksen ensisijainen havainto oli, että tällä hetkellä käytetyt yleiset MPXV-testit eivät välttämättä havaitse MPXV:tä optimaalisesti ja tarkasti. Asemasta riippumatta mikä tahansa epäsopivuus alukesekvenssin sisällä voisi heikentää aluke-templaatti-DNA-dupleksin lämpöstabiilisuutta ja vaikuttaa PCR:n suorituskykyyn. Kirjoittajat havaitsivat epäsopivuuden kahden aluketemplaatin välillä, joilla oli yhdistetty vaikutus PCR:n suorituskykyyn. Se antoi noin 11 kertaa huonomman arvion alkuperäisestä templaatti-DNA:sta ja nelinkertaisen 95 prosentin lisäyksen havaitsemisrajassa (LOD). Siksi epäyhteensopivuuskorjattu määritys, jossa alukkeiden ja nykyisten MPXV-genomien välinen absoluuttinen komplementaarisuus voisi mahdollistaa herkemmän ja tarkemman MPXV-tunnistuksen.

Lisäksi tutkimustulokset osoittivat, että geneettiset vaihtelut MPXV-genomin aluke-koetinalueilla voisivat viitata apinarokkotaudin ilmaantumiseen ajallisesti ja alueellisesti. Kolme määritystä, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 ja OPV_F8L, osoittivat korkeimman yli 99 %:n vastaavuuspisteen maailmanlaajuisen MPXV-genomitietokannan kanssa vuonna 2022. Määrityksen valinta vaihtelee kuitenkin myös näytetyypin mukaan. Nämä kolme testiä toimivat hyvin esimerkiksi kliinisissä näytteissä, mutta eivät jätevesinäytteissä, jotka saattoivat sisältää ihmisjätteitä sekä kissojen, koirien, hiirten, kanien ja lehmien ulosteita.

Diplomi

Tutkimuksessa kehitetty epäsopivuuskorjattu määritys osoitti yli 97 %:n komplementaarisuuden MPXV-genomien kanssa. Siten se osoitti korkeampaa herkkyyttä ja parannettua kvantifiointipotentiaalia ja se saattoi auttaa MPXV:n havaitsemisessa.

Parannetut MPXV-diagnostiikkaominaisuudet ovat kriittisiä, kun kansanterveysviranomaiset ja lääkärit taistelevat MPXV-epidemiaa vastaan. Tulevissa tutkimuksissa tulisi siksi keskittyä kehittämään vieläkin parempi MPXV-diagnostinen määritys, joka ottaa huomioon muut tekijät, jotka vaikuttavat diagnostisen tehokkuuden ja yhteensopimattomuuteen liittyviin vaikutuksiin (esim. templaatti-DNA:n laatu, PCR-perusseos ja aluke-dimeerin muodostuminen).

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Viitteet:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Artikkelin tarkistukset

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.