A jelenlegi majomhimlővírus-diagnosztikai tesztek primer- és próbaszekvenciájának eltéréseit ki kell javítani a kimutatás pontosságának javítása érdekében

A jelenlegi majomhimlővírus-diagnosztikai tesztek primer- és próbaszekvenciájának eltéréseit ki kell javítani a kimutatás pontosságának javítása érdekében

Egy nemrégiben megjelent tanulmányban medRxiv * Preprint Server, A kutatók elemezték az Egyesült Államok Betegségellenőrzési és Megelőzési Központja (CDC) primer- és próbaszekvenciáját, amelyet a majomhimlő vírus (MPXV) általános valós idejű polimeráz láncreakciós (PCR) vizsgálata javasolt.

Studie: Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. Bildnachweis: Dotted Yeti/Shutterstock

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek szakértők. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

háttér

Az MPXV, az Orthopoxvirus nemzetség egyik faja, kettős szálú dezoxiribonukleinsav (DNS) genommal rendelkezik. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 2022. július 23-án közegészségügyi vészhelyzetnek nyilvánította az MPXV újjáéledését, miután 106 országban több mint 66 000 esetet jelentettek. Az MPXV a második ilyen vírus, amely gyorsan terjed világszerte, miután a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) fokozatosan endémiás vírussá vált.

A SARS-CoV-2-vel kapcsolatban a CDC egy valós idejű PCR-tesztet tett közzé az MPXV kimutatására szennyvízmintákban, általános primerek és szondák segítségével, amelyek egy nyugat-afrikai és egy kongói medencét célzó MPXV törzset céloznak meg. Hasonlóképpen, más valós idejű PCR-vizsgálatok kimutatják az MPXV-t a klinikai mintákban.

A probléma az, hogy az ezekben az általános PCR-vizsgálatokban használt primerek és próbák olyan MPXV-törzseken alapulnak, amelyek csaknem egy évtizeddel ezelőtt, 2002 és 2009 között keringtek. Tekintettel az összes DNS-vírus gyors evolúciójára, az MPXV kimutatására használt oligók által megcélzott régióknak jelentős mutációkon kellett keresztülmenniük.

A tanulmányról

A jelen tanulmányban a kutatók 683 teljes MPXV genomot kerestek le a Global Initiative on Avian Influenza Data (GISAID) adatbázisból, amely 2022. augusztus 5-ig volt elérhető, és ezek oligoszekvenciáját a jelenleg használt MPXV diagnosztikai tesztek primer szekvenciáihoz igazították. Ezenkívül a hét valós idejű PCR vizsgálatban a primer- és próbaszekvenciákat, valamint azok fordított komplementjeit 1779 MPXV-genomhoz igazították, és 100%-os egyetértéssel számították ki a genomok százalékos arányát. Ezek a vizsgálatok az O2L, F3L, C3L és G2R géneket célozták meg az MPXV kimutatására.

A csapat három valós idejű PCR-vizsgálatot is értékelt az Orthopoxvirus nemzetségbe tartozó vírusok kimutatására. Végül a kutatók szintetizálták a hibás illeszkedést korrigált primereket vagy egy szintetikus MPXV génfragmenst, hogy teszteljék az eltérési hatásokat, és összehasonlították őket az MPXV kimutatására szolgáló általános teszttel.

Tanulmányi eredmények

1730 komplett MPXV genomot használtak fel a 2022-es globális járvány idején. A három oligoszekvencia és reverz komplementereinek egymáshoz illesztése az általános MPXV-vizsgálatokból generikus MPXV forward szekvenciákat (MPXV-F) eredményezett, amelyek 100%-os azonosságot mutattak négy genommal, és generikus reverz primereket (MPXV-R), amelyek a genomok 1,73%-ával egyeztek. Ezenkívül a kutatók 31 szekvencia eltérést találtak az MPXV generic forward szekvenciák (MPXV-F) 99,08%-ában, illetve 97,46%-ában, illetve 32 generikus fordított primerben (MPXV-R).

Míg az előbbi egyetlen szinonim mutációval, az A194165G-vel rendelkezik a közzétett MPXV genomok 99,08%-ában, az utóbbiban a genomok 97,46%-ában volt egy nem szinonim szubsztitúció, a G194233A. Éppen ellenkezőleg, az MPXV próbaszekvencia (MPV-P) konzervált volt, és az adatbázisban lévő genomok 99,31%-ához illeszkedett.

A tanulmány elsődleges megállapítása az volt, hogy a jelenleg használt általános MPXV tesztek nem feltétlenül mutatják ki optimálisan és pontosan az MPXV-t. A pozíciótól függetlenül a primer szekvencián belüli bármilyen eltérés csökkentheti a primer-templát DNS duplex termikus stabilitását és befolyásolhatja a PCR teljesítményét. A szerzők két primer templát közötti eltérést észleltek, amely együttes hatással volt a PCR teljesítményére. Ez körülbelül 11-szer rosszabb becslést adott a kezdeti templát DNS-re, és négyszeresére növelte a kimutatási határt (LOD), 95%-kal. Ezért a primerek és a jelenlegi MPXV-genomok közötti abszolút komplementaritású, hibásan korrigált vizsgálat érzékenyebb és pontosabb MPXV kimutatást tesz lehetővé.

Ezenkívül a vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy az MPXV genom primer-próba régióiban lévő genetikai eltérések a majomhimlő betegség megjelenésének időbeli és térbeli mintázatát jelezhetik. Három vizsgálat, az MPV_F3L, az MPV_G2R_WA, a 283 és az OPV_F8L mutatta a legmagasabb, több mint 99%-os összhangot a globális MPXV genomadatbázissal 2022-ben. A vizsgálati módszer kiválasztása azonban a minta típusától függően is változik. Ez a három teszt például jól működött a klinikai mintáknál, de nem a szennyvízmintáknál, amelyek emberi hulladékot, valamint macskák, kutyák, egerek, nyulak és tehenek ürülékét is tartalmazhatják.

Oklevél

A tanulmányban kifejlesztett eltérés-korrigált vizsgálat több mint 97%-os komplementaritást mutatott az MPXV genomokkal. Így nagyobb érzékenységet és jobb számszerűsítési potenciált mutatott, és segítheti az MPXV kimutatását.

A továbbfejlesztett MPXV diagnosztikai képességek kritikus fontosságúak, mivel a közegészségügyi tisztviselők és orvosok küzdenek az MPXV járvány ellen. A jövőbeli vizsgálatoknak ezért egy még jobb MPXV diagnosztikai vizsgálat kifejlesztésére kell összpontosítaniuk, amely figyelembe vesz más tényezőket is, amelyek befolyásolják a diagnosztikai hatékonyságot és az eltérésekkel kapcsolatos hatásokat (például a templát DNS minőségét, a PCR-főkeveréket és a primer-dimer képződését).

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek szakértők. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

Referenciák:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Fuqing Wu, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena, Eric L. Brown. (2022). Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Diagnosetests für das Monkeypox-Virus. medRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.10.22278644 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.08.10.22278644v2
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Wu, Fuqing, Jeremiah Oghuan, Anna Gitter, Kristina D. Mena und Eric L. Brown. 2022. „Große Fehlpaarungen in den Sequenzen von Primern und Sonden für Monkeypox-Virus-Diagnosetests.“ Journal of Medical Virology 95 (1). https://doi.org/10.1002/jmv.28395. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28395.

Cikk-revíziók

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.